pBV220载体中外源基因表达水平定量分析

运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术,分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平,结果表明：５‘－３０－３９区域和３’端３０－－３９区域的二级结构有与表达水平具有显的统计学意义;其次是３端９ｂｐ的局部密码子偏性,ＳＤ序列与起始密友子ＡＴＧ之间碱基数在８±３范围内与表达水平无显关系。另外,运用判别分析方法构建了判别函     

pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系

运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义,并运用Bays判别分析方法构建了判别函数,判别符合率为87.5％。     

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ技术,删除了小鼠ＣＲＥＢｃＤＮＡ５‘端和３’端非编码序列,并引入便于基因操作的酶切位点。经３０次循环的扩增,得到改造后的ＣＲＥＢｃＤＮＡ,全和工０７１ｂｐ。亚克隆后,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了ＤＮＡ序列,并以其为插入物,构建了ｐＢＶ２２０－ＰｃＲ ＣＲＥＢ重组表达载体Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析证明,在大肠杆菌中的表达获得成功。     

高效原核表达载体pBV220的改造与应用

以高效原核表达载体 pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点, 并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA, 将此新质粒命名为 pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白, 酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中, 在大肠杆菌DH5a中成功地表达了Nm23-H1蛋白, 通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。     

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因sgna的现有载体进行了改造,并引入筛选标记基因bar;为提高目的基因的表达水平,在目的基因5′端引入了Ω和kozak序列,3′端引入了poly(A)序列,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,基因pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-sgna及Ubi-bar基因表达盒,pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaNV35S-nptⅡ,Ubi-sgna和Ubi-bar基因表达盒,人工合成的雪花莲外源凝集素基因sgna可以编码对同翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,删除了小鼠CREBcDNA5′端和3′端非编码序列,并引入便于基因操作的酶切位点。经30次循环的扩增,得到改造后的CREBcDNA,全长1071bp。亚克隆后,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并以其为插入物,构建了pBV220-PCR-CREB重组表达载体。经Western印迹法分析证明,在大肠杆菌中的表达获得成功 。     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上,重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体,８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白,每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性     

大肠杆菌中外源基因的表达调节

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但基因的表达受到多种因素的调节,而且不同的外源基因在大肠杆菌中的表达效率也有很大差异。本文从转录水平调节、翻译水平调节、培养条件调节等方面综述了大肠杆菌中外源基因的表达调节,以便认识其规律,有助于使用有效的方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率。     

高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO

目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验 证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表达.方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得I L-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质粒经鉴定后转化到大肠杆 菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况.结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的 高效可溶性表达.利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟 蛋白且不残留任何氨基酸残基.结论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量.     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒/板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统.本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的cryparin基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体.构建的载体能成功表达GFP蛋白.利用该载体表达积累量较高的CHV1-Euro7病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10%提高至67%和80%.高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具.     

人可溶性白介素4受体(sIL4R)在大肠杆菌中的表达和纯化

白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂 ,应用于哮喘等疾病治疗 .采用RT PCR方法 ,以人单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序确证后插入大肠杆菌高效表达质粒pBV2 2 0 ,得到重组质粒pBV2 2 0 sIL 4R ,重组质粒转化E .coliDH5α .重组菌经温度诱导后超声破碎得到包涵体 ,经SuperdexHR75分子筛柱和DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱进行纯化 ,HPLC检测表明纯度达到 90 % .N端测序证明 ,重组sIL 4R与天然sIL 4RN端序列完全一致 .Western印迹、配基结合印迹对重组sIL 4R进行鉴定 .结果表明 ,重组sIL 4R具有结合IL 4的生物学活性     

Conversion of recombinant human ferritin light chain inclusion bodies into uniform nanoparticles in Escherichia coli for facile production

Prokaryotic expression systems are widely used to produce many types of biologics because of their extreme conveniences and unmatchable cost. However, production of recombinant human ferritin light chain (rhFTL) protein is largely restrained because its expression in Escherichia coli tends to form inclusion bodies (IBs). In this study, a prokaryotic expression vector (FTL‐pBV220) harboring the rhFTL gene was constructed using a pBV220 plasmid. The tag‐free rhFTL was highly expressed and almost entirely converted to soluble form, and thus the rhFTL was successfully self‐assembled into uniform nanoparticles in E. coli. To establish a simplified downstream process, a precipitation procedure based on the optimized incubation temperature, pH condition, and ionic strength was developed to remove impurities from the crude lysate supernatant. The rhFTL retained in the clarified supernatant was subsequently purified in a single step using Capto Butyl column resulting in a considerable recovery and high purity. The purified rhFTL was characterized and verified by mass spectrometry and spectral and morphological analyses. The results revealed that rhFTL exhibited highly ordered and fairly compact structures and the spherical structures were preserved.     

四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达

基于四膜虫小核rDNA改造得到的pD5H8载体,在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9000~10000拷贝的大核rDNA,因此pD5H8载体是四膜虫异源基因表达的研究热点;但其载体上匮乏合适的克隆位点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子HSP70-2和终止子HSP70-1之间,通过稀有酶切位点I-Sc e玉导入细菌绿色荧光蛋白(HGFP)这一筛选标记,由此组成的DNA片段(HSP70-25' UTR-I-Sce玉-HGFP-I-Sce玉-HSP70-13' UTR)整合进pD5H8,将之改造成pD5H8-HGFP表达载体。来自真核生物的绿色荧光蛋白(GFP)藉由I-Sc e玉酶切位点一步导入pD5H8-HGFP表达载体后,在四膜虫中大量表达且具有生物学活性。因此,改造后的pD5H8-HGFP表达载体拥有一步法引入异源基因,几乎无酶切位点的限制,有效的筛选标记,高效的异源基因表达能力,以及环境友好、便捷可控等诸多优点,这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础。     

一种可用于外源基因功能鉴定的真菌分泌表达载体74HSP-EGFP的构建及验证

传统的植物遗传转化体系能够鉴定植物基因的功能,但该过程烦琐、耗时长,且存在一定的局限性.本研究构建具有蛋白分泌信号肽和荧光蛋白EGFP的真菌分泌载体74HSP-EGFP,通过尖孢镰刀菌古巴专 化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)携带侵染巴西蕉(Musa nana)植株对载体上的...     

外源GUS基因在PEG介导的花椰菜原生质体中的瞬间表达

为了将外源基因导入花椰菜原生质体获得转基因植株,本文研究了ＰＥＧ介导的外源基因在花椰菜下胚轴原生质体中的瞬间表达。（１）２０％ＰＥＧ将质粒ｐＢＩ２２１导入原生质体后ＧＵＳ表达比１３％ＰＥＧ导入的高,但易造成原生质体损伤。（２）热激处理增强表达,但在随后的培养过程中易造成原生质体降解。（３）原生质体状况对表达有重要影响,５ｄ龄下胚轴原生质体比８ｄ龄的表达强。（４）不同质粒及启动子表达强度不同。质粒ｐＫＩＷＩ１０１比ｐＢＩ２２１表达强３倍左右。