扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

生物工程技术讲座[八]

应用微细胞检测基因产物的方法由于质粒和噬菌体等的DAN分子能在细胞内进行自我复制,以及DNA重组技术的普及,质粒DNA做为异源性DNA分子的载体,在基因工程中目前已被广泛应用。在克隆或分析真核生物或原核生物的多种不同基因时,常用检测基因表达来确定其存在。把含有某一目的基因的DNA片段和载体质粒的DNA进行重组,再通过重组DNA在受体细胞中的转录、翻译、     

酶和发酵工程

枯草杆菌(Bacillus subtilis)2633能超量生产α-淀粉酶(比其亲本品系枯草杆菌6160约高3000倍)。采用枯草杆菌-大肠杆菌穿梭载体 PHY 300 PLK 将枯草杆菌2633的一个α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中。当含有α-淀粉酶基因的重组质粒 PAM 26被导入枯草杆菌6160后,一个转换体大约可产生40000 U/毫升的α-淀粉酶,为枯草杆菌6160的4000倍。这表明2633的α-淀粉酶基因(淀     

产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

从淀粉厂附近的土壤中筛选到一株能够利用淀粉的细菌,对该细菌进行生理生化检测和16S r DNA同源性比对,分析该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。利用基因克隆技术得到了该菌株的β-淀粉酶基因,该基因含有一个约30个氨基酸的信号肽序列。将该β-淀粉酶基因重组进入质粒p ET-28a中,转化进入E.coli BL21(DE3)中进行表达。检测表达结果显示得到了重组后的β-淀粉酶蛋白质,重组酶的酶活力提高了53.9%。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrocccus furiosus的基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶成熟肽结构基因,插入pUC19中构建成质粒pUC19-amy,将pUC19-amy外源片段接入酿酒酵母表达载体pXY212多克隆位点,构建成载体pYX212-amy,电转化酿酒酵母W303-1A,转化子成功表达出有活性的高嗜热α-淀粉酶,重组酶具有P.furiosus产生的胞外α-淀粉酶相似的酶学性质,最适pH为5.0,最适温度约为90℃,在121℃下热处理30min酶活仍能保持50%以上。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

热稳定α—淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。     

疫苗

881180感染性重组病毒,含有所述猫白血病病毒疫苗及其生产方法〔专,英〕/Nunbe-rg,J .H.…1 European Patent Appl.EP 0216564.Pub.01 .04 .87.Appl.US.774040,filed 09.09.86〔译自CBA,1957, (6),2576〕 含有一个嵌合猫白血病病毒(FeLV)外壳基因的感染性重组病毒可用作猫白血病疫苗。用病毒DNA和一个插人性载体转染易感的哺乳动物细胞来制备病毒。该载体带有由在细胞内具活性的启动子、翻译起始密码子和为FeLV病毒外壳蛋白编码的一个DNA片段组成的嵌合基因。编码蛋白的DNA受控干启动子。用这种感染性重组病毒和一个衍生载体或…     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达*

用PCR方法从嗜热古菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶成熟肽结构基因 ,插入 pUC19中构建成质粒 pUC19 amy。将 pUC19 amy外源片段接入酿酒酵母表达载体 pYX2 12多克隆位点 ,构建成载体 pYX2 12 amy ,电转化酿酒酵母W 30 3 1A。转化子成功表达出有活性的高嗜热α 淀粉酶。重组酶具有与P. furiosus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适 pH为 5 0 ,最适温度约为 90℃ ,在 12 1℃下热处     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白。方法PCR扩增,获得HIV-1C亚型gp120片段,定向克隆人腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd—gp120,PacI酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd—gp120。结果经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd—gp120重组腺病毒;通过Western印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120kD的蛋白。结论成功构建了含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达。     

DNA基因库的同源重组筛选

专利为鉴别和分离真核寄主基因库中目标DNA的同源重组法(Ⅰ),包括:(a)制备真核细胞DNA基因库,其中可发生导入DNA与寄主细胞现有DNA间的重组;(b)导入在真核寄主细胞中可复制并含选择性标记基因,与目标DNA部分同源的DNA序列的目标DNA载体质粒YIp;(c)重组;和(d)选择转化体。专利还包括:(1)用(Ⅰ)分离到的哺乳动物、人或植物DNA或基因;(2)带至少缺失1个选择性标记染色体的酿酒酵母TD7-16d、IV-16d和MGD131-10;(3)质粒p184DLARG及其功能性等同物;(4)在     

α-葡萄糖苷酶基因序列分析及真核表达载体构建

目的：Aspergillus niger（CU-1）菌株α-葡萄糖苷酶基因（agdA）克隆并对其序列进行分析,构建该基因的真核表达载体。方法：设计合成的一对特异性引物,采用PCR以总DNA为模板,扩增得到DNA片段（D1）;采用RT-PCR方法扩增得到DNA片段（D2）。将DNA片段D1和D2转入大肠杆菌中并进行了序列测定,序列进行BLAST比对分析。将α-葡萄糖苷酶基因的cDNA片段与表达载体pGAPZαA连接,构建重组表达载体。结果：基因agdA大小为3 127bp,含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列大小为2 958bp,包含完整的编码框,编码985个氨基酸。agdA基因序列与已发表的α-葡萄糖苷基因序列同源性达99%,其中有6个位置的碱基发生了变化。已成功构建重组表达载体pGAPZαA-agdA。结论：Aspergillus niger（CU-1）菌株α-葡萄糖苷酶基因序列分析及重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建为在毕赤酵母中表达Aspergillus niger（CU-1）菌株的α-葡萄糖苷酶奠定基础。     

枯草杆菌表达载体pUB23的构建及地衣杆菌α-淀粉酶基因的表达

将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍.     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的透析复性方法,获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板,PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因,克隆至p ET-22b(+),转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况,采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白,相对分子量约为54.8k Da,成功复性包涵体,复性效率为22.78%,重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,包涵体经透析法成功复性,获得具有催化活性的重组淀粉酶。     

地衣形芽孢杆菌热稳定α淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

利用λ噬菌体作为运载体,在大肠杆菌中从直接鸟枪法分离出编码地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶的基因。将含有α-淀粉酶基因的片段再克隆进pBR322,并测定了它的限制性图谱。头肠杆菌克隆子所产生的α-淀粉酶保留了地衣形芽孢杆菌酶的热稳定性。检定了在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中这二基因产物的表达及性质。     

重组DNA技术用于生产蛋白质

重组DNA技术正在许多方面有所应用,建成的“工程细菌” (或酵母)可生产非常有价值的蛋白质如胰岛素、干扰素、α-淀粉酶、凝乳酶(chymosin)(BNW.,1983,3(9):4)和疫苗等(见表),这些蛋白质在医、工、农方面得到应用。     

基因工程

所克隆的DNA具有编码自交不亲和植物的S一位点糖蛋白的基础序列,已构建含有此克隆DNA.的新型重组DNA转移载体,同时获得了由此载体转化的新的微生物。还构建了编码S一位点特异的糖蛋白的嵌合基