汉坦病毒核酸疫苗在小鼠体内表达分布的初步研究

运用生物荧光技术,肌肉免疫接种小鼠含汉坦病毒S抗原基因片段的核酸疫苗,观察重组核酸疫苗在其体内的表达分布。进一步探讨汉坦病毒核酸疫苗的应用前景。扩增纯化已构建好的含有汉坦病毒S抗原基因片段和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pEGFP/S;免疫接种小鼠胫前肌,观察pEGFP/S在小鼠体内的表达分布。免疫接种3 d后在实验组小鼠肝、肾、脾、肌肉各组织均检测到较强的绿色荧光。重组质粒pEGFP/S能在小鼠的多个组织器官表达,为深入研究汉坦病毒核蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断.用特异性引物扩增出CCVDXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1.用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZ αAS1.将pPICZαAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右.用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达18-116,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

吉林地区HFRS病原体基因型分析

为调查吉林地区褐家鼠中汉坦病毒病原体基因型及其分布情况,采用免疫荧光法检测吉林市区及吉林市所属各县市收集的鼠肺标本,对汉坦病毒抗原阳性标本以巢式RT-PCR法扩增S基因片段上的核苷酸序列并测序,将扩增片段的核苷酸序列与已知病毒序列进行同源性分析及系统进化树分析.序列分析发现吉林地区褐家鼠携带的汉坦病毒均为汉城病毒,S3...     

融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...     

黑龙江省大林姬鼠中汉坦病毒的分离及其S基因序列分析

为了研究黑龙江省大林姬鼠携带汉坦病毒(HV)的分子特征,对黑龙江省大林姬鼠分离株NA33的S基因进行了扩增和序列分析。结果表明,NA33株S基因全长由1 693nt组成,TA含量丰富,编码N蛋白的ORF起始于37nt,终止于1 326nt,编码的蛋白长429aa,符合HTN型编码。与HV参考毒株进行比较,NA33与Amur类汉坦病毒同源性最高,与其它HTN型相对较低,与SEO等同源性更低。N蛋白进化树分析表明,NA33位于Amur类病毒所在支系,并且与俄罗斯远东和吉林大林姬鼠分离株亲缘关系更接近,体现了一定的宿主依赖性和地理簇集性。序列分析发现,NA33的N蛋白具有Amur类汉坦病毒保守的氨基酸位点。黑龙江省大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒,是重要的传染源。     

一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选

目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果.生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白.将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照.通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白.结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81-140片段之间存在着特异性的相互作用.结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子.     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征因热（HFRS）的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物－黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HGTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源民生较差,从种系发生树分析来看,HNT261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76－118株在一个分枝内,就其核苷酸和蛋白的同源性说,HT N261株和HTN76－118株的同源性分别是89％（全S基因）和98％（蛋白）。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差,汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76－118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11％和2％,表明HTN261株和HTN76－118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。     

汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征出血热(HFRS)的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物-黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进行了测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源性较差。从种系发生树分析来看,HTN261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76-118株在一个分枝内。就其核苷酸和蛋白的同源性来说,HTN261株和HTN76-118株的同源性分别是89%(全S基因)和98%(蛋白)。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差。汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76-118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11%和2%,表明HTN261株和HTN76-118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。     

汉坦病毒嵌合基因 G2S0.7在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学研究

在前期工作基础上,对汉坦病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因G2S0．7表达产物的免疫学特性进行进一步的研究。将汉坦病毒含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中融合表达并免疫BALB／c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果,以研究嵌合基因的免疫效果。结果表明,用该融合蛋白免疫小鼠,可诱导产生抗汉坦病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1：3200及1：200;同时融合蛋白还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉坦病毒G2S0．7嵌合基因表达的融合蛋白既可刺激机体产生特异性的抗汉坦病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答,为进一步进行汉坦病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆、序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的Vero-E6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kb cDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76-118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%.将该基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物为GST-NP融合蛋白.SDS-PAGE检测表达蛋白分子约72kD左右.Western blotting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76-118株相比存在某些差异.     

狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中,经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT—PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCV标准毒株Insavc—1N基因相比,核苷酸的同源性为92．6％,推导的氨基酸的同源性为93．2％。在推导的N蛋白N端156—179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc—1株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET8a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IFTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49．3％,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。     

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。     

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录

目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c-ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原.将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%,推测的氨基酸同源性为99.3%,证实为BTV的S7基因.然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体.经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原.SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54.5kD,重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右,相当于93.5mg/L菌液.融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.     

Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫学研究

目的:对以轮状病毒(RV)重组VP6蛋白为载体插入Ⅲ型脊髓灰质炎病毒(PV3)VP1蛋白上1个抗原表位(VP1的91~102、254和168位氨基酸残基)所构建的嵌合蛋白6F/PV3N1进行体外免疫学研究。方法:利用分子克隆和基因重组技术将PV3抗原表位插入RV载体蛋白,构建重组抗原表位嵌合蛋白表达质粒,转染大肠杆菌后表达重组蛋白,经SDS-PAGE确认表达产物,再通过Western印迹分析嵌合蛋白的抗原反应性。结果:用载体蛋白VP6F、轮状病毒Wa病毒株免疫的豚鼠血清抗体分别都能与VP6F和6F/PV3N1产生特异性结合;PV3免疫的豚鼠血清抗体只能与6F/PV3N1产生特异性结合,不能与VP6F产生特异性结合;PV1免疫的豚鼠血清抗体则不能与6F/PV3N1和VP6F产生特异性结合。结论:PV1、PV3之间不存在交叉反应现象,以RV VP6为载体构建的嵌合蛋白6F/PV3N1具有较好的免疫原性,为研发RV/PV3嵌合疫苗提供了基础。     

SARS冠状病毒结构蛋白在血清学诊断中潜在应用价值的比较

为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性。从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达。以表达的蛋白为抗原,应用Western blot跟踪检测11例SARS患者血清54份。结果显示：SARS—CoV的重组N蛋白和s蛋白有很强的抗原性,s蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和s2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和s3蛋白抗体检出率分别为40％、65。2％、100％、100％和40％、61％、76.2％、100％;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c—ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原。将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98．7％,推测的氨基酸同源性为99．3％,证实为BTV的S7基因。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原。SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54．5kD,重组蛋白的获得率为1．52mg／g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12％左右,相当于93．5mg／L菌液。融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。