铝与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

本文研究了铝与钙调蛋白相互作用的荧光光谱。实验证明,Al~3与CaM的结合所引起的构象变化与Ca~(2+)与CaM结合所引起的构象变化既有相同之处,也有不同之处。Al~(3+)在CaM分子上的结合有特异性结合与非特异性结合两种情况。其特异性结合位点可能为2—3个。钙调蛋白的非竞争性拮抗剂酸枣仁皂甙A(JuA)可以继续抑制已被Al~(3+)部分抑制的PDE-CaM的活力。     

铝与钙调蛋白相互作用及其作用位点的研究

用500MHzNMR研究了铝与钙调蛋白的相互作用,主要研究了铝对钙调蛋白中芳香氨基酸残基(Tyr,His,Phe)构象变化的影响。实验结果表明,铝在钙饱和的钙调蛋白上存在着特异性的结合位点,结合位点数目至少为两个,第一结合位点可能位于钙调蛋白的N端结构域,第二结合位点靠近Ca~(2+)的Ⅲ结合域。Al~(3+)结合引起脱钙的钙调蛋白的构象变化不同于与Ca~(3+)结合引起的构象变化。Al~(3+)在CaM上的结合位点与Ca~(2+)的并不相同。柠檬酸等有机酸对铝的毒性有保护作用,这种保护作用是由于柠檬酸分子对铝的络合。     

酸枣仁皂甙A与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

文中报导了本实验室最近发现的一种新型钙调蛋白(CaM)天然拮抗剂——酸枣仁皂甙A,它能显著地抑制CaM活化PDE的活力.为研究它与CaM间的相互作用,本实验还制备了与天然CaM具有相同激活PDE能力的丹磺酰钙调蛋白(D-CaM).D-CaM的荧光光谱研究表明,酸枣仁甙A的加入诱导CaM分子的疏水位点更加暴露,从而增强丹磺酰基团的荧光发射量子产率.桔抗剂与CaM间的结合是绝对依赖Ca~(2 )的.荧光滴定的结果证明此结合的解离常数为2.8μM.酸枣仁皂甙A能进一步加强三氟啦嗪(TFP)所诱导的D-CaM荧光增强.这结果暗示,它不与TFP竞l争CaM上相同的结合位点.     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段，Ｍｅｌ １２，Ｍｅｌ １３，Ｍｅｌ １４，Ｍｅｌ １５。应用电泳技术，抑制钙依赖性的磷赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙蛋白的相互作用，结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物，抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性，其中Ｍｅｌ １４和Ｍｅｌ １５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。     

钙调蛋白的自旋共振研究：拮抗剂和它的相互作用

利用碘乙酰胺氮氧自由基标记钙调蛋白研究了它与三氟拉嗪（ＴＦＰ）、酸枣仁皂甙Ａ（ＪｕＡ）的相互作用。结果表明,每分子ＣａＭ分别至少可以结合两分子的ＴＦＰ及ＪｕＡ,它们的作用影响了ＣａＭ上的Ｍｅｔ残基（主要是７１,７２和７６）的环境,使反应自由基运动自由度的旋转相关时间τＲ值下降。据τＲ变化的趋势,推测ＴＦＰ和ＪｕＡ都是通过疏水作用结合到ＣａＭ上的疏水沟区,但两者的结合位点可能不同。     

外源钙调蛋白对植物细胞分裂增殖作用的研究

外源钙调蛋白（ＣａＭ）对胡萝卜悬浮细胞增殖具明显促进作用,不同浓度ＣａＭ的促进程度不同,７μｇ／ｍｌ时促进作用最大。ＣａＭ抑制剂ＴＦＰ则明显抑制该悬浮细胞的增殖,ＴＦＰ浓度越高则抑制作用越强。另外,外源ＣａＭ可以加快珍珠梅花粉第二次有丝分裂,改变生殖细胞有丝分裂各期花粉管的比例,说明外源ＣａＭ对植物体细胞和性细胞的增殖和分裂均有促进作用。     

钙调蛋白结合蛋白,类肌钙蛋白和脊椎动物平滑肌收缩的调节

平滑肌细胞包含有粗肌丝、细肌丝和中等纤维。一般认为Ｃａ＾２＋／ＣａＭ依赖性的肌球蛋白磷酸化作用是平滑肌收缩的重要调控环节。然而,新近在平滑肌中发现钙调蛋白结合蛋白和类肌钙蛋白,它们也参与平滑肌收缩的调节。     

粉防已碱与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

粉防已碱Tet是一种新的钙调蛋白(CaM)拮抗剂,它抑制CaM活化的Ca~(2 )—Mg~(2 )—ATP c。利用丹磺酰钙调蛋白(D—CaM)可方便地鉴测Tet与CaM的相互作用,直接证明了在CaM与Tet之间生成复合物CaM—Tet 我们制备的D—CaM,每个蛋白分子含1.3个丹磺酰基团,活化红细胞膜Ca~(2 )—Mg~(2 )—ATP c的生物活性与天然CaM基本相同。 当Ca~(2 )与D—CaM结合时,丹磺酰基团环境疏水性增加,该荧光团产生较高的量子产率(增加1.6倍),最大发射兰移(从512移兰至495nm)。存在Ca~(2 )时,Tet使D—CaM的荧光强度进一步增加,谱线继续兰移,表明Ca~(2 )及Tet诱导蛋白构象变化,改变了丹磺酰基团的微环境。 荧光滴定实验证明CaM与Tet结合的解离常数为1.8μM,两者的结合是绝对依赖Ca~(2 )的。 药物Tet与CaM的结合可增强结合在CaM上的荧光探剂NPN的荧光,提示CaM不同疏水结合位之间存在变构相互作用。     

Tb~(3+)作为荧光探针研究钙调蛋白与拮抗药物的相互作用

本文报导以Tb~(3+)作为荧光探针,研究钙调蛋白(CaM)与其拮抗药物分子间相互作用的机制.所用方法简便、快速、灵敏.CaM的内源荧光研究表明,Tb~(3+)类似于Ca~(2+),也能诱导CaM分子构象发生改化,由于CaM分子中Ca~(2+)的第Ⅲ、Ⅳ结合位点上各有一个Tyr线基,如(?)280nm激发,则发生从Tyr向Tb~(3+)的能量转移,从而导致Tb~(3+)在490和545nm处的特征荧光发射大大加强.本文检测了药物分子与Tb~(3+)-CaM结合对该荧光发射的影响.实验表明,TFP与CaM的高亲和位点处于CaM分子C-末端部位,即含第Ⅲ、Ⅳ结构域的半分子上:丙拮抗药物酸枣仁皂甙A则优先结合在含第Ⅰ、Ⅱ的结构域的另一半分子(?).     

PAMP和脂双层相互作用的荧光光谱和付立叶变换红外光谱研究

本文用荧光光谱技术和付立叶变换红外光谱研究了ＰＡＭＰ和脂质体的相互作用。ＰＡＭＰ与带负电磷脂作用后,其内源性荧光光谱峰位兰移,其荧光强度更不易被碘离子猝灭,提示ＰＡＭＰ和脂作用后其发荧光的色氨酸可能由水相移至疏水相。我们用自旋标记磷脂的猝灭实验测量了ＰＡＭＰ的插膜深度。ＦＴＩＲ实验表明,ＰＡＭＰ和带负电磷脂双层作用后将诱导ＰＡＭＰ的结构改变。     

茶碱与胃蛋白酶相互作用的光谱性质研究

采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了茶碱与胃蛋白酶的结合作用。观测到茶碱使胃蛋白酶的紫外吸收峰增强,特征荧光峰淬灭。Stern-Volmer淬灭曲线显示,茶碱对胃蛋白酶的荧光淬灭很可能是一个单一的静态淬灭过程。     

自旋标记钙调蛋白与酸枣仁皂甙A相互作用研究

中草药有效成份酸枣仁皂甙A是钙调蛋白CaM的一种天然非竞争性拮抗剂。利用氮氧自由基马来酰亚胺衍生物标记CaM研究了二者的相互作用。结果表明,每分子CaM至少可以结合二个分子的酸枣仁皂钙A,二者的作用影响CaM上Lys残基主要是75,94)的环境,推测酸枣仁皂钙A是通过疏水作用结合到CaM分子两端的疏水沟区。通过比较三氟拉嗪TFP与酸枣仁皂甙A的结构特点,抑制性质与结合位点,提出了CaM调节环核苷酸磷酸二酯酶PDE的模式。     

癌症病人血液的荧光光谱研究

研究了癌症病人全血、血浆和血红蛋白的激发波长—发射波长—荧光光强三维光谱,观察到特征谱带625nm的荧光本原物质存在于血红蛋白部分,比较了十五种癌症(28例),十例非癌症病人和健康人血液在625nm带的荧光强度.     

天花粉凝集素的荧光光谱研究

天花粉凝集素在天然状态下荧光发射峰位于３３２ｎｍ处,以丙烯酰胺,ＫＩ及ＣｓＣ１等淬灭剂研究ＴＫＬ分子中Ｔｒｐ残基的微环境,发现只有丙烯酰胺能淬灭ＴＫＬ分子Ｔｒｐ的荧光,同此推断大部分的Ｔｒｐ残基位于ＴＫＬ分子内部,其荧光不易为Ｉ＾－或Ｃｓ＾＋接近而淬灭。疏水探针ＴＮＳ能够检测到ＴＫＬ中疏水微区的存在,并且这一疏水微区亦不同于ＴＫＬ的半乳糖结合位点,ＴＫＬ中不存在金属离子的结合部位。     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段：Ｍｅｌ１２、Ｍｅ１１３、Ｍｅｌ１４、Ｍｅｌ１５。应用电泳技术,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙调蛋白的相互作用。结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性,其中Ｍｅｌ１４和Ｍｅｌ１５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。     

癌症病人血液的荧光光谱研究

研究了癌症病人全血、血浆和血红蛋白的激发波长—发射波长—荧光光强三维光谱,观察到特征谱带625nm的荧光本原物质存在于血红蛋白部分,比较了十五种癌症(28例),十例非癌症病人和健康人血液在625nm带的荧光强度.     

白茯苓凝集素的荧光光谱研究

白茯苓凝集素（ＳＬＬ）分子中含有４个色氨酸（Ｔｒｐ）残基,ＮＢＳ修饰测得这４个Ｔｒｐ残基位于分子表面。ＳＬＬ在天然状态下荧光发射峰位于３３５ｎｍ处,离子强度和温度对其荧光光谱均无明显的影响。ＮＢＳ修饰后的ＳＬＬ失去凝血活性,相应荧光光谱的强度减弱,荧光发射峰发生蓝移,提示ＳＬＬ的构象发生改变。用ＫＩ·ＣｓＣｌ和丙烯酰胺淬灭剂研究ＳＬＬ分子中Ｔｒｐ残基的微环境,发现丙烯酰胺和ＣｓＣｌ能淬灭分子中１００％和５０％的Ｔｒｐ残基的荧光,而ＫＩ完全不能淬灭ＳＬＬ分子中Ｔｒｐ残基的荧光,因此Ｔｒｐ残基周围存在阴离子区,或者Ｔｒｐ残基处于分子表面的疏水环境中。     

果蝇钙调蛋白和肌球蛋白NINAC相互作用分析

果蝇的视觉信号转导途径是已知的最快的G 蛋白偶联信号通路。这其中涉及到TRP/TRPL通道的开放以及钙离子的内流等一系列反应的形成。NINAC（neither inactivation nor afterpotential C）是一种特异性存在于果蝇感光细胞中的第3类肌球蛋白（Myosin III）,其在终止果蝇的视觉信号转导通路中起着非常重要的作用。NINAC蛋白具有两种亚型：一种是132 kD的蛋白亚型 (p132),另一种则是174 kD的蛋白亚型(p174)。这两种不同的蛋白亚型都具有相同的激酶催化结构域(kinase domain),以及与肌球蛋白相似的马达结构域(motor domain)。但是,它们在C末端却存在着非常大的差异,这其中包括了钙调蛋白结合基序(IQ motif)。NINAC的这两种蛋白亚型在果蝇的感光细胞中的定位以及作用有很大不同,尤其是在与钙调蛋白的相互作用方面。钙调蛋白结合基序与钙调蛋白（CaM）之间的相互作用对于果蝇的视觉信号通路具有重要的意义：NINAC结合钙调蛋白能力的缺失将导致果蝇的视觉传导缺陷。本文通过蛋白共表达的方法,成功表达并纯化得到了不同版本的NINAC与钙调蛋白的蛋白复合物。静态光散射的结果表明,在Ca2+存在情况下,p174蛋白可以结合2个Ca2+-CaM,而p132只结合1个Ca2+-CaM。通过分析型凝胶过滤以及等温量热滴定技术,进一步鉴定了p174及p132的IQ2（第2个钙调蛋白结合基序）序列与Ca2+ CaM的相互作用。通过序列分析及进一步的突变实验发现,p174 IQ2中的3个疏水氨基酸（F1083,F1086 和 L1092）对于钙调蛋白的结合非常重要,并导致了p174与p132蛋白和Ca2+ CaM结合能力的差异。本文的研究提供了NINAC与Ca2+-CaM相互作用的生化机制,将为进一步在果蝇视觉信号通路中深入研究CaM是如何调节NINAC的体内功能实验打下基础。