蓖麻毒素—A链结构功能研究进展

蓖麻毒素（ｒｉｃｉｎ）是一种核糖体失活蛋白,是构建免疫毒素的一个重要成分,本介绍近年来ｒｉｃｉｎ－Ａ链的理化性质和制备,结构功能关系及其Ｎ－苷酶作用机制方面的研究进展．     

核糖体RNA拓扑学与RNAN－糖苷酶研究进展（上）

核糖体ＲＮＡ拓扑学的研究对阐明核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）在蛋白质生物合成中的作用具有重要的意义。ＲＮＡＮ－糖苷０酶是一类核糖体失活蛋白．它只水解ｒＲＮＡ特定位置上一个腺苷酸的糖苷键,释放一个腺嘌呤碱基,使核糖体失活。ＲｉｃｉｎＡ链是研究得最早和最详细的ＲＮＡＮ－糖苷酶,迄今已发现有二十五种核糖体失活蛋白具有ＲＮＡＮ－糖苷酶活性。ＲＮＡＮ－糖苷酶作用于２８ＳｒＲＮＡ的α－ｓａｒｃｉｎ结构域,改变核糖体的构象而使其失活。     

蓖麻毒素A链的基因克隆

作为导向药物蓖麻毒素A(Ricin-A)链在大肠杆菌中表达时不含糖基侧链,在体内半衰期长,可提高共作为导向药物的疗效。我们根据Ricin基因核苷酸序列,设计Ricin-A的上、下游引物,通过PCR(多聚酶链式反应)方法,扩增出Ricin-A链基因。与pUC_(19)载体连接,转化到JM103大肠杆菌中,得到重组克隆。对其进行几种酶切鉴定,证明酶切位点正确,又经序列分析,读出与文献发表的Ricin-A序列只有两个碱基不同,但无氨基酸残基的改变。有关Ricin-A的表达工作正在进行中。     

Adducin与高血压

Ａｄｄｕｃｉｎ是一个新发现的与高血压发病有关的基因。Ａｄｄｕｃｉｎ是细胞骨架的一种组成蛋白,在膜连接和膜骨架的形成与维持中起重要作用。Ａｄｄｕｃｉｎ基因的突变可能导致细胞骨架的改变,引起Ｎａ－ＫＡＴＰ酶及细胞信息的改变,从而引起高血压病的发生。     

蓖麻毒素A链突变体的设计,表达与活性研究

利用蛋白质结构同源模建并结合表观静电势分析,设计了拟具有生物学活性的蓖麻毒素Ａ链的突变体。将ＰＣＲ扩增的突变体基因,导入ｐＫＫ２２３－３载体中,于大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中获得高效、可溶性表达,而且,确证了表达产物具有预期的生物学活性。     

抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达

通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ３为载体,在大肠杆菌ＪＭ８３中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ－２２ｂ（＋）为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,３０℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白     

抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定

为探索控制水稻条纹叶枯病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）设计合成了特异切割该病毒ＲＮＡ保守区及编码病害特异性蛋白（ＤｉｓｅａｓｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰ）基因的核酶,核酶基因的长度均为４０个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其３＇－末端互补的１５个碱基引物,用ＴａｇＤＮＡ多聚酶合成其互补链。双链ＤＮＡ直接插入克隆载体ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶体外转录得到核酶ＲＮＡ。当核酶ＲＮＡ与以同样方法转录得到的靶基因ＲＮＡ混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。     

重组抗体—尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得高效、高特异性溶栓药物,应用基因工程技术,成功的表达了由人源化抗人活化血小板单抗和单链尿酶组成的抗体导向溶栓剂（ＳＺ５１Ｈｕ－ｓｃｕＰＡ）。通过基因重组ＰＣＲ方法将ｓｃｕＰＡ全长ｃＤＮＡ的Ｎ末端连接在ＳＺ５１重链恒区ＣＨ３末端,构建了含有目的蛋白融合基因的真核表达载体αｌｙｓ３０－ＳＺ５１ＶＨ／Ｈｕ－ｓｃｕＰＡ。采用脂转染法将表达载体导入分泌ＳＺ５１ＶＫ／Ｈｕ轻链的小鼠骨髓瘤细胞中,筛选出     

苏云金芽孢杆菌δ—内毒素cryIA（c）基因在大肠杆菌和变铅青链？…

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽直菌δ－内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ＰＫＫ２２３－３重组,并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＩＰＴＧ诱导,获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ＰＨＺ１２７２中,得到重组质粒,ＰＨＺ１２５６,将该质粒引入变铅青链霉菌ＪＴ４６中,经硫链丝菌素诱导,通过Ｗ     

烟草β—1,3—葡聚糖酶cDNA克隆,大肠杆菌表达及植物表达载体的 …

用０．１５％乙烯利诱导烟草幼苗后,提取叶片总ＲＮＡ,并通过反转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出β－１,３－葡聚糖酶基因的ｃＤＮＡ。将其克隆至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ后,完成了此基因的全序列分析。测序结果表明：所克隆的ｃＤＮＡ除第１００８位碱基与所报道的不同外,其它序列完全一致。为制备抗血清,构建了此基因的大肠杆菌表达载体,并在表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳ中得到表达,进行了Ｗ     

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶ ｔｓＫ株辅助下进行复制和包装,并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ,以及它的应用。该质料中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一     

醋酸杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆、表达及在啤酒发酵中的作用

根据α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,α－ＡＬＤＣ）基因的碱基序列,用ＰＣＲ方法从醋酸杆菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）中克隆出了０．９９ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序后证明该片段是α－乙酰乳酸脱羧酶基因．将该基因重组到质粒ｐＢＶ２２０中,转化大肠杆菌,筛选获得具有α－ＡＬＤＣ活性的重组子菌株．酶活检测表明,重组子细胞表达的α－ＡＬＤＣ活性是供体菌的１１００倍．将得到的α－ＡＬＤＣ粗提后用于啤酒发酵试验,降低了啤酒中双乙酰的含量     

特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯地病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的核酶序列,以体外转录的ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负链ＲＮＡ作为底物,与转录的核酶ＲＮＡ共同保温,以检测核酶对底和的体外切割作用。实验结果表明,核酸疼 ＲＮＡ对ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负锭ＲＮＡ具有特异切割作用。     

黑子南瓜甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

依据国外报道的南瓜甘油－３－磷酸转酰酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ序列合成相应引物,用ＲＴ－ＰＣＲ技术,成功地分离了黑子南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段,并亚克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上,序列分析表明黑子南瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ序列及递推的氨基酸序列与南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ）相比分别具有９８％和９６５％的同源性。在１１８８ｂｐ中有２２个核苷酸发生变化,导致１３个氨基酸的改变     

人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,ＰＭＡ诱导后,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,扩增出去了Ｎ端信号肽序列的ＩＬ１１ｃＤＮＡ,经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅３个核苷酸有变化,氨基酸序列一致。将此ＩＬ－１１ｃＤＮＡ克隆人硫氧还蛋白基因融合表达载体ｐＴＲＸＦＵＳ的ｔｒｘＡ基因３‘末端,利用其３’端的蛋白肠激酶切点。构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量法２０％以上。用ＩＬ－６依赖细胞株７Ｔ     

人IgG Fc基因克隆及人源抗HBsAg全分子抗体在CHO …

利用ｍＲＮＡ提取试直接从健康人外周血白细胞中提取ｍＲＮＡ,逆转寻为 ｃＤＮＡ,合成引物扩增人抗体分子ＩｇＧＩ亚型Ｆｃ基因,克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ中并测序。合成引物扩增人抗体分子轻,重链信号肽序列,分别克隆并测序将轻链信号肽和轻链（ｋａｐｐａ）ＶＬ－ＣＬ基因进行重组形成轻链全分子基因,再将其克隆到哺乳细胞表达载全ｐｃＤＮＡ３．１中。将重链信号肽、重链（ｇａｍｍａ）ＶＨ－ＣＨ１和Ｆｃ基因进行     

麦迪霉素产生菌中具强启动活性DNA片段的结构与功能分析

用启动子探针质粒ｐＩＪ４８６从麦迪霉素产生菌（Ｓ．ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）中克隆到１个具启动功能的ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ２．０ｋｂ片段,含该片段的重组质粒ｐ４Ｈ２转化子在ＭＭ基本培养基上对卡那霉素（Ｋｍ）抗性可达５００μｇ／ｍｌ以上。亚克隆缺失分析结果表明,该片段不同部分的缺失对启动活性有不同程度的影响,说明它具有较复杂的转录调控机制。ＤＮＡ序列分析结果显示,该片段含有１９８４个核苷酸,其Ｇ＋Ｃ％为４７．７％,不存在典型的链霉菌的可读框;进一步的分析发现,其６５０ｂｐ、１１５０ｂｐ和１５００ｂｐ区域分别与麦迪霉素酮基还原酶基因等链霉菌基因的启动子序列具有同源性;在５２０－５７０ｂｐ区域与大肠杆菌ｔＲＮＡ基因上游激活序列（ＵＡＳ）有较好的同源性,提示链霉菌中可能存在可增强基因转录的ＤＮＡ元件。     

可降解淀粉和产生酒精的酵母工程菌的构建

采用基因重组技术将黑曲酶糖化酶ＧＡＩ ｃＤＮＡ与ＭＦ－α１因子的启动子－信号序列及ＰＧＫ基因的转录终止位点重组进大肠杆菌－酵母穿梭质粒构建酵母表达载体ＹｅｐＭＧＴ２０,用原生质体转化法引入酒酵母ＧＲＦ１８,在酵母ＭＦ－α１启动子－信号序列及ＰＧＫ终止位点的调控下,实现糖化酶的高表达,９９％的酶活力分泌至胞外,构建的酿酒酵母ＧＲＦ１８（ＹＥｐＭＧＴ２０）在１０％淀粉的培养基中培养４８ｈ,淀粉水解率达     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及 …

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３）连接,制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗,可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ）。为纯化及核素标记抗体,将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达,表达量占菌体总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ｋＤ,与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为     

蓖麻毒素A链突变体(MRTA)的分子设计

利用同源模建的方法,借助分子力学优化,分子力学模拟退火设计构建了删除部分氨基酸序列的蓖麻毒素Ａ链突变体。采用泊松－玻尔兹曼方程对比分析了蓖麻毒素Ａ链与ＭＲＴＡ表现静电势分布,研究了ＲＴＡ与ＭＲＴＡ蛋白表面静电性质;