D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

透明颤菌血红蛋白对两种D-氨基酸氧化酶的不同影响及机理研究

D-氨基酸氧化酶是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)这一半合成头孢类抗生素的主要前体的关键酶.它催化的反应是需氧反应,反应体系的溶氧水平是酶活的限制因素之一.我们发现将纯化的透明颤菌血红蛋白(VHb)分别添加到三角酵母来源(TvDAO)和红酵母来源(RgDAO)的D-氨基酸氧化酶的纯酶中,可提高这两种氧化酶的活力35%和48%.细菌双杂交实验证明,透明颤菌血红蛋白与RgDAO有相互作用,而与TvDAO没有关联.这说明透明颤菌血红蛋白对氧化酶活力的促进是由于自身向氧化酶提供游离氧,而且它与氧化酶之间的相互作用可以增强这种效果.我们可以利用透明颤菌血红蛋白的这种性质把它作为氧化酶酶促反应的添加剂,提高酶促反应的效率,如果该氧化酶与之有相互作用,效果会更加显著.     

透明颤菌血红蛋白的应用进展

透明颤菌血红蛋白（VHb）具有在限氧条件下促进异源宿主细胞生长和增加产物产量的作用,已在发酵、环保、转基因动植物、重组蛋白表达等方面得到了广泛应用。将VHb与酶或蛋白融合表达可提高酶的活性、稳定性或蛋白的分离效率。对VHb进行改造有助于获得性能更良好的"新"蛋白。     

基因工程菌表达D-氨基酸氧化酶研究进展

用分子克隆手段获得D-氨基酸氧化酶基因后,对其在不同表达系统如大肠杆菌系统、酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母、博伊丁假丝酵母、巴斯德毕赤氏酵母系统及动物细胞内的表达作了介绍。     

透明颤菌血红蛋白的表达及其对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌血红蛋白基因,构建了一批复制类型和抗生标记不同的ｖｇｂ表达载体,并就ｖｇｂ基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明ｖｇｂ基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至２０％饱和度时迅速合成。ｖｇｂ基因的表达产物可促进青霉素酰化酶和ＴＮＦ、ＩＬ－２等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于ｖｇｂ基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发     

透明颤菌血红蛋白的研究进展

血红蛋白广泛存在于动植物、微生物中,是一种氧结合蛋白。透明颤菌血红蛋白是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白,该蛋白质能使细菌在低氧的情况下生存,并保持较高的生长速率。随着作用机理研究深入,透明颤菌血红蛋白在发酵工业和植物转基因等生物工程领域有着广泛的应用。     

透明颤菌血红蛋白的研究与发展前景

在缺氧条件下,透明颤菌血红蛋白(VHb)通过促进氧输送增强呼吸和能量代谢,并在各种宿主中表达,显示出改善增长,蛋白质分泌,代谢产物的生产力和提高宿主抗逆性等的生理效应,从而使蛋白质在代谢工程尤其在优化植物代谢中应用前景广阔.概括了VHb在生物技术工业的诸多研究领域中的应用潜力,探讨VHb功能的细胞机制,并显示出各领域所采取的各种方法.     

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述郭宏秋,杨胜利（中国科学院上海生物工程研究中心,上海２００２３３）在生物技术日益产业化的今天,特别是随着基因工程技术的飞速发展,为生产新的生物产品带来了可能,有些产品已进人商业化生产,像干扰素、白细胞介素、生长激...     

透明颤菌(沈阳株)血红蛋白基因克隆与序列分析

目的：以透明颤菌（Vitreoscilla）基因组DNA为模板,扩增透明颤菌血红蛋白基因（vgb）。方法：采用PCR81与摹甲季缉彗术,将PCR产物插入到克隆载体PET28a中,测序应用DNA测序仪。结果：获得了约0．5kbDNA片段,测序结果与已发表的透明颤菌血红蛋白基因核苷酸序列比较,同源性为97％。结论：所扩增的DNA片段确认是透明颤菌血红蛋白基因。     

透明颤菌血红蛋白基因的研究与应用

总结了近 15年来透明颤菌血红蛋白的研究结果 ,包括它的分布、结构、功能、合成等分子生物学以及在基因工程中的应用。透明颤菌的血红蛋白是 2 0世纪 70年代被发现的 ,由于它具有结合氧的特性 ,可使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长。透明颤菌血红蛋白是同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子 ,每分子透明颤菌血红蛋白由两个分子量为 15 775的亚基和两个b型血红素组成。透明颤菌血红蛋白的功能是为透明颤菌强大的呼吸膜增加氧的流量。完整的有功能的血红蛋白由血红蛋白亚基和血红素组成 ,血红蛋白亚基由基因vgb编码 ,血红素由生化代谢合成。透明颤菌血红蛋白基因在野生透明颤菌中是以单拷贝的方式随染色体一起复制表达的。透明颤菌血红蛋白基因已经被克隆和测序。同时也讨论了将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中增加重组蛋白产量和发酵产量方面的研究。最后 ,概述了当透明颤菌血红蛋白在植物中表达时 ,转基因植物表现出生长增加以及代谢物产量发生变化的情况。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。     

D型氨基酸氧化酶活性对于D-硝基精氨酸手性转化的影响

D-硝基精氨酸(D-NNA)可在大鼠体内发生手性转化生成其L型异构体,即L-NNA,后者可抑制一氧化氮合酶活性,减少一氧化氮生成,升高动脉血压.研究了D型氨基酸氧化酶(DAAO)在D-NNA手性转化中的作用及DAAO对不同(包括已报道在体内可发生手型转化的)D型氨基酸的选择活性.体内实验显示,DAAO的选择性抑制剂苯甲酸钠(400mg/kg)或肌酐(400mg/kg)均可在不同程度上抑制D-NNA升压作用,进一步研究发现,肾脏或肝脏DAAO酶液在外加DAAO后可提高D-NNA的手性转化约2倍,表明DAAO对于D-NNA在体内的手性转化是必需的.DAAO酶液对可在体内发生手性转化且转化率相似(30%～50%)的D型氨基酸(D-Phe,D-Leu和D-NNA)的选择性表现出显著差异(Kcat/Km相差可达约15倍左右),这从另一方面表明体内D-硝基精氨酸氧化是其发生手性转化的前提条件但非决定因素.     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对基因细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌（S.cinnamonensis)是莫能菌素（Monensin)的产生菌,大肠杆菌－链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因（vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子ＰtipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的ＶＨb蛋白,摇瓶发酵实验证明,ＶＨb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

Fusion protein of Vitreoscilla hemoglobin with D-amino acid oxidase enhances activity and stability of biocatalyst in the bioconversion process of cephalosporin C

In this study we constructed an artificial flavohemoprotein by fusing Vitreoscilla hemoglobin (VHb) with D-amino acid oxidase (DAO) of Rhodotorula gracilis to determine whether bacterial hemoglobin can be used as an oxygen donor to immobilized flavoenzyme. This chimeric enzyme significantly enhanced DAO activity and stability in the bioconversion process of cephalosporin C. In a 200-mL bioreactor, the catalytic efficiency of immobilized VHb-DAO against cephalosporin C was 12.5-fold higher than that of immobilized DAO, and the operational stability of the immobilized VHb-DAO was approximately threefold better than that of the immobilized DAO. In the scaled-up bioprocess with a 5-L bioreactor, immobilized VHb-DAO (2500 U/L) resulted in 99% bioconversion of 120 mM cephalosporin C within 60 min at an oxygen flow rate of 0.2 (v/v) x min. Ninety percent of the initial activity of immobilized VHb-DAO could be maintained at up to 50 cycles of the enzymatic reaction without exogenous addition of H(2)O(2) and flavin adenine dinucleotide (FAD). The purity of the final product, glutaryl-7-aminocephalosporanic acid, was confirmed to be 99.77% by high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. Relative specificity of immobilized VHb-DAO on D-alpha-aminoadipic acid, a precursor in cephalosporin C biosynthesis, increased twofold, compared with that of immobilized DAO, suggesting that conformational modification of the VHb-DAO fusion protein may be altered in favor of cephalosporin C.     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能     

Kinetic Resolution of 3-Fluoroalanine Using a Fusion Protein of D-Amino Acid Oxidase with Vitroscilla Hemoglobin

In this study, a fusion protein (VHb-DAAO) of D-amino acid oxidase (DAAO) with Vitreoscilla hemoglobin (VHb) was functionally expressed in Escherichia coli and purified. The k _cat value VHb-DAAO (47.1 s^?1) towards rac-3-flouroalanine was about 2-fold higher than that of DAAO (21.9 s^?1). rac-3-Flouroalanine (500 mM) was kinetically resolved into (R)-3-fluoroalanine with high enatiomeric excess (>99%) by VHb-DAAO with about 52% conversion.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT2-EGFP融合蛋白的表达与鉴定

谷氨酰胺转运蛋白是中枢神经系统中一种重要的中性氨基酸转运蛋白,对谷氨酰胺的跨膜转运十分重要。为了更方便地研究大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)在细胞膜上的表达与定位,利用亚克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构建于SNAT2的C端,通过菌液PCR、酶切和DNA测序鉴定重组真核表达质粒;将测序正确的重组质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T cells),用Western blot和激光共聚焦电子显微镜荧光检测技术鉴定SNAT2-EGFP的表达与亚细胞定位。结果表明,SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒在细胞中表达并正确定位于细胞膜上。SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒的成功构建为今后深入研究SNAT2的结构和功能提供了一个有效的工具。