杂交瘤细胞培养的优化

根据杂交瘤细胞培养中单克隆抗体生产的动力学原理,采用灌注培养方式、添加醋酸钾和丰富营养物培养的途径,对反应器放大培养过程进行了优化。每天灌注l／2反应器工作体积,与分批培养相比,细胞密度由4 5×10⁵／ml提高到l1×10⁵／ml,单抗浓度由19mg／L提高到28mg/L;添加1g／L醋酸钾,细胞密度基本保持不变．但单抗浓度增加到38μg／ml;用丰富营养物培养后,细胞密度和单抗浓度分别进一步提高到42×10⁵／ml和94mg/L。抗B型红细胞单抗的血凝滴度,由分批培养的1：32．最终提高到l：256     

葡萄糖的添加对昆虫细胞Sf21悬浮生长的影响

添加葡萄糖对昆虫细胞Sf21(Spodoptera frugiperda)悬浮生长的影响,发现补加糖量在lg／L时·能明显提高细胞生长的速度和最高密度,细胞最高密度由2．5×10⁴／ml增加到4.9×10⁶／ml; 朴加糖量在2g／L时,则有显著的抑制作用,即使增加接种密度．细胞生长的最高密度也只有2．1×10⁶／ml。当采取流加葡萄糖方法来培养细胞时,则其生长的最大密度可提高到5．2×10⁶／ml。     

厚叶景天组织传感器的研究

利用厚叶景天的叶和茎组织作为生物催化材料,分别同二氧化碳气敏电极和氨气敏电极组合,研制了L－精氨酸传感器及,L－赖氨酸传感器。两种传感器的线性范围分别为1.0×10^-4 1.O×10^-3mol/L和8．0×10^-5—3.0×10^-3mol/L．检测下限分别为3．2×10^-5mol／L和2.2×10^-5mol/L,响应斜率分别为42.2mV／dec和41．4mv／dec。考察了两种传感器的回收率．结果表明,L－精氨酸传感器和L－赖氨酸传感器的回收率平均值分别为98．6％和101.6％,标准偏差分别为4.6％和4.0％。     

酵母完整细胞快速高效转化法

通过研究影响转化效率的诸因素,最终找到一种快速、高效酵母完整细胞转化法。整个转化步骤能在1．5h内完成。在实验中发现：小牛胸腺DNA的加入,在加入DNA后随即加入PEG4000;将42℃热冲击时间从5min延长到25min;热冲击后直接将转化混合物涂布到选择性平板上能得到高效转化效率。所用四种类型质粒的转化效率如下：Yrp;3．5—7．2×10⁴(线性pcN60／BamHⅠ：1·6×10⁵);Yep: l·7—2.6×10⁴(线性YEpl3／BarnHⅠ：8×10⁴),Ycp：3．7×10⁴;YIp5／stuI：7．6×10³。用快速法检测的7株受体菌的转化能力都达到10⁴个转化子/μg DNA。     

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Cytodex 1、Cy-todex 3、Biosilon、Bellco Glass Microcarrier、CT-1、CT-3、MC-1、CT-28种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Biosilon作为Vero细胞高密度培养的首选微载体。用500mlWheaton搅拌瓶探索影响Vero细胞高密度培养的条件,表明50～60mg/ml的微载体浓度、1～2×10⁶/ml的细胞接种密度、适当的通气(95％O_2+5％CO₂)对该细胞的高密度培养具有重要意义。在200ml培养体积的Wheaton搅拌瓶中,微载体浓度为50～60mg/ml,细胞接种密度为9.24×10⁵/ml,搅拌速度为65～85r/min,经25d培养,Vero细胞密度可达2.34×10⁷/ml,表明50～60mg/ml的微载体浓度对培养细胞没有毒性。接着在1.5L CelliGen生物反应器中进行培养,细胞接种密度为4.98×10⁵/ml,培养体积为1.2L,日灌流量从0.20L逐渐加大到3.65L,经22d连接灌流培养,最终细胞密度可达2.05×10⁷/ml。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPo作为抗原,免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与x63Ag8．653小鼠骨髓瘤细胞融合,再碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEpo,包被Pvc板,对杂交瘤用ELlSA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG1、IgG2b,轻链均为k链,Kd分别为5．53×10^-10mol／L和1．34×1O^-10mol／L．用western blot方法证明两者对hEPO具有高度韵专一性．能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测．     

滇紫草培养细胞中色素合成的代谢调节

培养基中分别加入浓度为10^-5mol／L的铜离子,滇紫草愈伤组织中色素含量提高了5．5倍,悬浮细胞中色素含量提高8．1倍。细胞培养第21天,加入浓度为10^-5mol／L的L-Phe,色素的合成量最大。浓度为10^-6mol／L的抗坏血酸,能明显地促进培养细胞中色素的合成。     

微生物传感器测定维生素B12的研究

将大肠杆菌(Escherichia coli)215用吸附法固定于醋酸纤维素膜上,与氧电极配合组成微生物电极,建立了对维生紊B₁₂的快速测定系统。测定浓度范围5×10^-6mg—2．5×10^-5mg／ml;测定温度范围在28—39℃;最适Ph为6．7—7．8,测定一个样品所需时间为2h,比常用的生物学测定方法所需时间缩短10倍以上。该系统对维生素B₁₂重复测定的相对误差为±3％。固定化菌体在－25℃保存25天后再进行测定,应答电流不低于初始值的92%。     

在中空纤维细胞培养系统内用无血清培养基生产单克隆抗体

用1640SFM无血清培养基在VF－2中空纤维细胞培养系统内培养7E8杂交瘤细胞,最大活细胞密度为2．34×10⁶／ml,该活细胞密度分别是转瓶培养和静态瓶培养结果的3．7倍和2．2倍。培养42天共收获7E8细胞培养液10000ml,其单克隆抗体(简称单抗)的ELIsA效价为1:20000左右,该效价是转瓶培养和静态瓶培养结果的25倍。ID。0mI培养液经50％饱和硫酸铵盐析和sephadex G-200柱层析提纯,获纯化单抗IgG 51．82mg。该系统平均每天生产单抗12．3mg。研究结果表明;在中空纤维培养系统内用无血清培养基培养杂交瘤细胞的方法可望用于体外大规模生产单抗。     

微生物电极快速测定微生物浓度的研究

利用前文所描述的微生物电极,测定了酵母菌、大肠杆菌和枯草杆菌三种微生物的标准曲线。其基本原理是：微生物在厌氧条件下将硫茧还原,还原态硫堇在阳极上氧化,而电流的最大上升速率与微生物的浓度成线性关系。对酵母菌、大肠杆菌和枯草杆菌的检测低限分别为5×10⁵、2×10⁶和1×10⁵ cells／ml。检测时间一般少于20min,重现性误差小于5％．本文还讨论了温度、染料浓度和磁搅拌转速等因素对微生物浓度测定的影响。     

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及特性

用杂交瘤技术制备了5株产生抗黄曲霉毒紊B₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中之一AFB1－2H8进行了较系统的研究。AFB1一2H8属IgC3。纯化腹水抗体效价约5×10⁶。ELISA检测标准毒素的线性范围为0．5～50ng／ml。最低检出量为0．01ng／ml。该单抗与参试的其它黄曲霉代谢物的交叉反应系数为0～0．21,该抗体有较大的应用价值。     

葡萄糖氧化酶产生菌Z—l—C的分批发酵与恒化培养

本文对葡萄糖氧化酶产生菌z—I—c的分批发酵与恒化培养进行了研究。实验发现,在以葡萄糖为生长限制性基质的恒化培养中,该产生菌的维持系数为O．04 g葡萄糖／g菌体．H,生长得率系数Y^max_G=O．714 g菌体／g葡萄糖,最大比生长速率μmax=O．385h^-1,饱和常数Ks=4．76g/L,理论最适稀释度Dm=0．260h^-1,最大酶比活(E／x)max为2．16×10³μ／mg,其值较分批发酵的最大酶比活(1．5l×10³μ／mg)提高43％。当向恒化培养的补料培养基中添加0．02％的α-甲基-D-葡萄糖时,由于该葡萄糖结构类似物的诱导作用,可使(E／x)max达3．11×10³μ／mg,较分批发酵之值提高106％。     

NIH／3T3，C-11细胞基因文库的构建以及成纤维蛋白质DNA片段克隆的分离

本文以λAGTl0为载体,用两种不同的方法建立了NIH／3T3,C-11细胞基因文库,所得重组子值分别为：6×10⁵pfu,2.5x10⁶pfu,1.8x10⁶Pfu,1.4×10⁶pfu均超过了建库要求的理论值。并且从C-11细胞基因文库中分离出成纤维蛋白质DNA片段克隆,使得这-DNA片段竞隆到PBR322质粒中。     

一株单粒包埋类型的红缘灯蛾NPV

发现一株新的ＡＩＮＰＶ,与已报道的明显不同。其多角体呈三角形,直径１．０～１．２４μｍ,单粒包埋型,每多角体内含５２～７８个大小为２９８～３７５×４１～５６ｕｍ的病毒粒子。核衣壳大小为２８０～３５８×３６～４５ｕｍ。该病毒株具较强毒力,以２×１０^６～２×１０^７ＰＩＢ／ｍｌ的浓度感染３龄幼虫,６ｄ死亡率达８４．２～９２％,ＬＣ_５０为１×１０^４ＰＩＢ／ｍｌ,浓度与死亡率的回归方程为ｙ＝３．２８＋０．４３ｘ。     

搅拌式生物反应器中造血细胞的灌注培养

为了消除造血细胞静态培养中存在的浓度梯度和搅拌悬浮培养时换液引起的波动,为造血细胞体外扩增提供更理想的培养环境和操作方式,利用自主开发的造血细胞重力沉降截留系统结合有溶氧和pH控制的生物反应器进行了脐血造血细胞的灌注培养。两次灌注培养中总细胞分别扩增11.5和18.6倍,扩增倍数最大时,CFU-Mix分别扩增23.2倍和20.4倍、 CFU-GM扩增13.9倍和21.5倍、BFU-E 扩增8.0倍和6.9倍、CD34⁺细胞扩增17.1倍和15.4倍。培养到12d时,第一次实验由267×10⁶单个核细胞扩增得到1082×10⁶个总细胞,6.31×10⁶个CFU-GM,6.2×10⁶个CFU-Mix和23×10⁶个CD34⁺细胞;第二次实验由180×10⁶单个核细胞扩增得到1.080×10⁶个总细胞,4.65×10⁶个CFU-GM,11.0×10⁶个CFU-Mix和25.0×10⁶个CD34⁺细胞,这达到了临床规模,由于控制了较低的溶氧和稳定的培养环境,细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶。但灌注培养到后期细胞密度达到较高后,细胞生长受到抑制,这应该是由细胞密度过高本身所引起。搅拌式反应器中进行灌注培养有利于造血干/祖细胞的进一步扩增,培养得到的细胞中干/祖细胞含量较高,培养规模达到了临床要求,但过高的细胞密度将对造血细胞的生长产生抑制。     

酵母乙醇脱氢酶电极的研究

从面包酵母中筛选到一株乙醇脱氢酶活力高、杂酶干扰小的菌株。对该菌株进行扩增培养,在72h收获,用此酵母制成测定乙醇浓度的生物电极,该电极测量的线性范围为3．4×10^－5～2．04×10^－3mol/L,r=0．9996,响应时间小于2min,甲醇、叔丁醇、异成醇的干扰分别为1．2％、2.0％、34％,醋酸和葡萄糖不干扰。测定乙醇标准样品的相对标准偏差为1．6％（n=6）,测定白酒发酵样的相对标准偏差为3．1％（n＝6）。     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

快中子辐射诱变和盐培养基选择红豆草耐盐愈伤组织变异系的研究

用中子通量为1．85×10¹¹—1．56×10¹³N／cm2的快中子辐射生长旺盛的红豆草愈伤组织,然后转移至含30、40、50、60和70％海水的Ls-1固体培养基上进行选择。选择得到的TS-9050、TS-1150和TS-1460三个耐盐变异系,抗盐性有显著提高,并在含70％的海水培养基上保持了分化为再生植株的能力。     

人肿瘤坏死因子及其突变体的基因工程下游工艺研究

研究了重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)及其突变体[Lys²]-人肿瘤坏死因子[Lys²]-rhTNFα)的基因工程下游工艺。rhTNFα和[Lys²]-rbTNFα的温控表达工程菌株在B-BTaunE 10型15L自控罐中经发酵每升可得50g湿菌体。rhTNFα和[Lys²]-rhTNFα的表达水平仍能保持在50％以上,且表达产物为可溶性蛋白。所得菌体经超声破菌、硫酸铵沉淀,然后依次用DEAE—Sepharose FF、CM-Sepharose FF和Sephacryl S-200柱层析进行分离纯化,由每升发酵液菌体最终可得1g左右的纯品,纯度达到98％左右,rhTNFα的比活为～1.5×10⁸IU／mg,[Lys²]－rhTNα的比活为～6×10⁸IU／mg。