产金属硫蛋白酵母菌原生质体电融合研究

采用原生质体电融合技术,由不能水解淀粉、细胞生物量低,只抗Cu²⁺、金属硫蛋白(MT)中cys含量高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,a)单倍体BD101-25和具淀粉水解能力、细胞生物量高、Cu²⁺、Cd²⁺抗性高、金属硫蛋白中cys含量低的异常毕赤酵母(Pichiaamomala,a)单倍体BD102-13获得4个融合株。融合组合有两亲株属间融合和单一亲株种内融合两类。融合株细胞体积、DNA含量均近似于两亲株细胞之和,并具有水解淀粉能力,Cu²⁺、Cd²⁺抗性高,细胞生物量高,MT中cys含量高等特点。属间融合株Cu²⁺、Cd²⁺抗性的遗传性状稳定。     

耐热酵母与酿酒酵母原生质体融合的研究

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)396是利用甘蔗糖蜜生产酒精的生产菌株,假丝酵母(Candida sp·)C₆是我们从云南温泉底泥中筛选到的一株能在45℃生长良好的耐热酵母,我们应用原生质体融合技术进行了两菌株属间融合的研究。通过亚硝基胍(NTG)诱变得到的营养缺陷型菌株396(arg^－)和C6(lys^-),其融合频率为O．91×10^-5。从检出的融合子中挑选6株进行考核、其细胞体积平均为亲株的1．3倍,DNA含量平均为亲株的1．6倍,培养特征、形态、大小和生理生化特征表现不一,特别是糖类的同化试验。除F₂、F₁₄外,其他4株可以排除异核体形成的可能性。比较了在28℃,40℃和45℃培养条件下出发亲株396、C₆、直接亲株396(arg^-)C₆(lys^-)和融合子F₁、F₇、F₁₂,F₁₃的生长曲线、基质利用率和乙醇产率等,得到一株在40℃培养条件下糖的利用率为94．3％、乙醇产量为59．7g／L的属间融合株F₁₃。     

酿酒酵母与糖化酵母的种间原生质体融合及其融合子的鉴定

本文报道了酒精生产菌株K氏酿酒酵母Sacchormyces cerevisiae var.ellipsoideus的HUK-1(his-,二倍体,但在我们所试的5种产孢培养基上均不产孢)与糖化酵母Sac—charomyces diastaticus 7c(arg-,a)的种间原生质体融合,其营养标记互补的融合频率约是2．07×10^-6—3．40×10^-5。这些融合子曾在选择培养基MMs或Mmo上连续传代10次,以促进两亲核的融合。融合子的酒精发酵特性,细胞形态、体积大小、DNA含量、繁殖速率、发酵强度以及产孢能力等方面的观察和测定结果表明,均不同于双亲菌株。用显微操作器解剖了个别原养型融台子HU—KDF—185的4孢子子囊,在获得的93个单孢株中,其淀粉发酵特性和遗传标记均有双亲类型的分离或重组现象。上述实验结果充分证明了不同倍性的酵母之间可以通过原生质体融合获得种间杂种。     

酵母菌属间原生质体融合：构建高产麦角固醇的优良品系

采用属间原生质体融合技术,对麦角固醇含量较高、细胞生物量低的裂殖酵母（Ｓｃｈｚｉｏｓａｃｃｈ－ａｒｏｍｙｃｅｓ）单倍体ＹＧ－１－１４－５８（ａｍｅｔ^－ｔｒｐ^－）与细胞生物量较高、麦角固醇含量低的酿酒酵母（Ｓｕｃｃｈ－ａｒｏｍｙｃｅｓ）单倍体ＹＧ－２８－３２－１３５（ａａｄｅ^－ｈｉｘ^－）进行原生质体融合,在高渗基本选择培养基上挑选融合子,并对获得的大量融合子进行了形态、生理生化、遗传稳定性、细     

链霉素生产菌—灰色链霉菌和热灰紫链霉菌的原生质体融合的研究

本文采用原生质体融合技术,把链霉素生产菌——灰色链霉菌No．45 Streptomyces griseus No.45(Lin,Rif‘)同耐高温的不产生抗生素的热灰紫链霉菌T272 Strep-griseus thermogriseoviolaceus T272(Lin^s,Rif^f)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,以PEG6000为助融剂,选出了融合体。制备超薄切片后在电镜下观察了原生质体融合的详细过程。在链霉素生物合成受抑制的高温(37℃)下,测定了融合体的抑菌括性,从形态上与两亲株不同的46株融合体中发现6．3％的融合体既有耐高温的特性也有抑菌的活性。     

酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能

通过单倍体分离和紫外诱变,获得了１４株树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）７１２４和酿酒酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１３００的营养缺陷型突变株。用聚乙二醇（ＰＥＧ）和电诱导融合及致死融合等方法,实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精,其厌氧发酵木糖和木糖葡萄糖混合液的能力明显优于亲株,耐酒精的性能也比亲株树干毕赤酵母７１２４有所提高。融合子经ＤＮＡ含量、细胞体积测定和稳定性能实验证明为稳定融合子。     

电融合技术选育能利用木糖和纤维二糖生产乙醇的菌株

以携带营养缺陷型标记的季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii s 208 Arg-)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 314)为亲本,采用GH-40l型电诱导基因转移／细胞融合仪,用3个强度为18kV／cm,时程为10μs,间隔为1 s的高压电脉冲处理原生质体,营养互补的融合频率为3．6×10^-3。在选择和非选择培养基上连续传代20余次后,对得到的稳定的融合子进行分析比较,结果表明,它们是两亲株融合后形成的融台体。其中有两株融合子能利用木糖和纤维二糖生产乙醇,F－106利用D－木糖(2％)和纤维二糖(2％)生产乙醇的产量分别为3．1g／l和1．05g／l,F－308分别为0．2g／I和2．8g／l。     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

黑曲霉原生质体电融合研究

以NTG和UV分别对生淀粉糖化酶菌株——野生型黑曲霉N 11,N一16(Aspergillusniger)进行诱变处理获Lys^-和Arg^-两类营养缺陷型。采用纤维素酶和蜗牛酶复合酶处理其菌丝并探讨了酶浓及菌龄等因素对原生质体形成和再生的影响。以BAEKON-2000型基因转移仪将上述营养缺陷型进行原生质体电融台处理。产生高融合率的最佳参数为：脉冲幅度4．5kV,脉冲数32,脉宽62．5μs,电激时间0.2s,距离3mm,周期数10。融合率可达60％。经连续传代7次获得4株稳定的融合子,经孢子体积,核DNA含量,生长速度测定证明上述融合子是种内杂合二倍体。以PFA处理得稳定的单倍体分离子。     

酵母菌属间原生质体融合获得能发酵乳糖生产酒精的融合体

本文报道了用聚乙二醇(PEG)诱导酿酒酵母 （Saccharomyces cerecisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)属间原生质体融合。融合体的细胞体积约为两亲株之和;融合体的DNA含量约为亲株的两倍;融合体具有双亲株的遗传标记。融合体不仅能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖和蜜二糖,而且也能发酵乳糖。在以乳糖为碳源的培养基中,融合体的发酵力是亲株乳酸克鲁维酵母的两倍多;在以葡萄糖为碳源的培养基中,融合体与亲株酿酒酵母的发酵力接近。     

原生质体融合技术提高啤酒酵母凝絮性的研究

融合亲株ＡＨ－４（Ａｓｐ^－ＩＬｅ^－）和ＺＦ－１８（Ｈｉｓ^－Ｌｙｓ^－）细胞于３０％ＰＥＧ浓度下,５０ｍｍｏｌ／Ｌ诱导融合３０分钟,筛出ＦＰ－１９融合株,融会场率为１．２×１０^－５。融合株细胞的体积和ＤＮＡ含量均约为两亲株细胞之和。融合株既具有较高发酵度,又有较强凝絮性的特点。     

放线菌种间原生质体电融合育种

以龟裂链霉菌(S．Rimosus,Otc^r,Sm ^s)和灰色链霉菌(S．Griseus,Sm^r,Otc^s)为原始出发菌株,经NTG诱变处理,获得前者(Asp^-)和后者(cys^-)营养缺陷型突变株,制成10⁹个／m1等量原生质体混合液,在岛津细胞融合装置SSH—C¹¹融合槽(电极间距为0．5mm)内,以频率lMHz、强度800V／cm的高频交流电场作电介质,电泳15s形成原生质体珠串,旋即施加电场强度6 kV／cm、短时程20μs的直流高压方形电脉冲触发原生质体融合,在R₃再生培养基上选取34971个菌落,移植于双抗基本培养基,检出四个双抗原养型融合子。它们具有亲株的优良生物学特性,生长速度较快,产素能力大,抗菌活性高。生物显影结果表明,它还产生两个亲株所不具有的抗菌活性物质。     

电诱导酵母属与短梗霉属属间融合的研究

本文报道了经GH一401 型电诱导细胞融合、基因转移仪诱导实现的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae NK491) 与出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans NKB93—0061eu)的原生质体电诱导融合。在融合小罐中用3个强度为11 Kv／cm,时程为10μs的高压电脉冲处理原生质体,获得的融合子营养互补的融合频率为5.8×10^-5。在选择培养基上连续传代10次,然后在完全培养基上传代20次,最终得到4株稳定的融台子。融合子的细胞形态、大小、核的DNA含量以及酒精发酵等特性的观察和测定表明,4株融合子与双亲均有明显差异。实验结果表明,电诱导原生质体融台对酵母菌的属间融合是一种行之有效的方法,具有较高的融合频率。     

链霉菌原生质体种间融合——产抗生素的耐温型重组子的选育

以庆丰链霉菌(SM^r,42℃不能生长,产庆丰霉索,可抑制细菌生长)与吸水链霉菌井冈变种(sM5,42℃生长良好,产井冈霉素,不抑制细菌生长)为亲株,在42％PEGl000诱导下进行原生质体融合,在含SM 100μg／ml,42℃培养的再生平板上直接选择耐温型融合子,融台率为1O^-5—1O^－4左右,经分离传代后可得到稳定的耐温型的单倍体重组子,即可在42℃生长,并且有链霉素抗性和抑制细菌生长的活性。初步测定了四个重组子产生的抗菌物质的性质,都与亲株产生的庆丰霉素、井冈霉素不同,其中F1－38,F1－16和IFM3－32三个重组子的抗生素在波长274mm处有一个紫外吸收小峰,而重组子F6-6有二个活性部分,其一在紫外线下呈荧光,另一则具有酸碱指示剂特性。     

诺卡氏菌原生质体融合重组研究

本文报道Nocardia sp.48(Str^r Rif^s)和Nocardia sp．189(Str^sRif^r)原生质体融合结果。42％PEG6000获最高融合频率。经一定时间的表型延迟后检出抗性互补的融合子。用电子显微镜观察了原生质体融合过程。融合子形态多样,耐双药性状稳定。有四株融合子产生亲本没有的甾体转化中间休．三株融合子产生亲本没有的抗生物质,还得到一株甾体转化活力明显高于亲本的融合子。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2的聚合及分子标记选择

冈46B(G46B)是水稻生产应用中的一个农艺性状十分优良的保持系 ,其主要的缺陷是稻瘟病抗性较弱 ,通过对地谷 ,BL-1,Pi-4号等三个分别含抗病基因Pi-d(t)¹、Pi-b、Pi-ta² 的稻瘟病抗性材料与G4-6B聚合杂交 ,并利用抗病基因连锁的分子标记对杂交后代进行辅助选择 ,在聚合杂交的F2代及B1C1代群体中共获得了 15株含Pi-d(t)¹ 、Pi-b、Pi-ta² 等三个抗稻瘟病基因的材料 ,其可能的基因型分别为 :三基因杂合体Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²4株 ,双基因杂合体 10株 ,其中Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²6株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta² 3株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bPi-b-Pi-ta² pi-ta² 1株 ,双基因纯合体Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta²仅1株 ,这一研究结果为进一步改良G46B的稻瘟病搞性奠定了基础,同时这一研究结果表明利用分子标记可快速、有效地实现多个抗病基因的聚合,大大提高水稻抗病育种的效率。     

金属硫蛋白产生菌的诱变育种*

采用亚硝基胍和紫外线诱变,自金属硫蛋白（ＭＴ）产生菌酿酒酵母（ｄｅｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＤ１０１－２５单倍体中获得遗传稳定的高Ｃｕ^２＋、Ｃｄ^２＋抗性突变株ＢＤ１０１－６９和ＢＤ１０１－３０。并对其重金属解毒、桔抗ｕ．Ｖ．和６０Ｃｏ辐射效应、清除羟基自由基能力等生物学功能进行了研究。与出发菌株相比,上述生物学活性与酵母细胞对Ｃｉ^２＋抗性、ＭＴ表达量表现出正相关性。两个突变株类ＭＴ表达量与生物学活性皆有所提     

利用淀粉产生碱性蛋白酶工程菌的构建

以不能利用淀粉为碳源、抗ｐｐ系列噬菌体和ｐＬ１噬菌体、产碱性蛋白酶（９４００－９８００ｕ／ｍｌ）的ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＣ１７２－６０为受体株,采用原生质体转化技术将携带糖化型小淀粉酶基因（Ａｍｖ）、Ｃｍ^ｒ基因、Ｋｍ^ｒ基因的ｐＢＸ９６质粒导入到受体株内,经两次利福平抗性筛选,获得一株能直接利用淀粉为发酵碳源、保留噬菌体抗性、产碱性蛋白酶的工程菌Ｃ１７２－３０６（ｐＢＸ９６）。菌体增殖９６．５代质粒丢失率为０．７７％,摇瓶发酵蛋白酶活力１４０     

抗酸酵母遗传特性的初步研究

研究了酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）单倍体突变株YNN-27-24（a trp^-ura^-）对乳酸抗性产生原因及其遗传特性。结果表明,该突变株对乳酸的抗性不是由于对环境条件的适应,而是由基因突变所致。通过对A13-18（alys^-）和YNN-27-24进行杂交得到的30株杂交子代的遗传特性进行分析可以看出,YNNM-27-24突变株对乳酸和潮霉素B（HygromycinB）的抗性,均由单基因控制,并且