谷氨酸传感器及在流动注射分析中的应用

利用谷氨酸氧化酶(简称GO)共价偶联于硅烷化铂化铂丝(Φ0．5mm)表面。构建一种简单的微酶电极,该电极具有良好的操作性能;应用于流动注射分析系统(FIA),可用来测量谷氨酸含量,测量范围。0－2．0mmo1/L,精度(CV为o．4％)、响应时间小于60秒,使用寿命大于20天,实际测量发酵液中各氨酸含量,回收率为98．7％一107．5％。     

谷氨酶传感器及在流动注射分析中的应用

利用谷氨酸氧化酶共价偶联于硅烷化铂化铂丝表面。构建一种简单的微酶电极,该电极具有良好的操作性能,应用于流动注射分析系统,可用来测量谷氨酸含量,测量范围０－２．０ｍｍｏｌ／Ｌ,精度、响应时间小于６０秒,使用寿命大于２０天,实际测量发酵液中谷氨酸含量,回收率为９８．７％－１０７．５％。     

固定化谷氨酸氧化酶管流动注射测定谷氨酸的研究

多孔玻璃珠固定谷氪酸氧化酶与过氧化氢酶分别制成相应的固定化酶管,结合流动注射分析系统测定谷氨酸的含量。测定线性范围在0．1—2．O mmol／L．精度(c．V)O．7％．测定速率每小时80样以上．使用寿命至少4个月。在各氨酸浓度低于2．5mmol／L时．pH在6．5—8．0．温度20—35℃．磷酸盐浓度在0.05—0.25mol／L范围内对测定几乎无影响．对不同发酵时间的谷氨酸发酵液测定,测定的结果与酶试剂盒及瓦氏法比较,结果一致．说明该方法已具有实际应用价值。     

谷氨酸氧化酶电极的研究

用戊二醛作交联剂将谷氨酸氧化酶和牛血清白蛋白共交联,置于内层醋酸纤维素抗干扰膜和外层聚碳酸酯扩散控制膜之间,制成酶膜,将其与过氧化氢探头复合制成了扩散控制型谷氨酸氧化酶电极,并构建了采用该电极的流动注射分析芽纺。酶电极红性范围0—1000mg／L。50s响应电流达稳态值的95％。流动注射分析系统响应时间20s,检测速度60次／h,线性范围5—8 000mg,L,酶膜使用寿命两周以上。系统选择性好,仅对干扰物L－谷氨酰胺和L－天冬氨酸有微弱响应。对同一样品连续测定41次的变异系数2．8％。测量味精发酵液和瓦勃呼吸计的结果相吻合。可望应用于味精发酵及食品工业中。     

植物组织切片谷氨酸传感器的研究

本文应用南瓜中果皮组织切片与BSA-戊二醛交联,然后与二氧化碳电极偶合组成了南瓜组织切片谷氨酸传感器.对电极的动力学响应特性,适宜的缓冲介质,不同pH及温度对电极响应的影响;电极的选择性及使用寿命作了研究。该电极在5.0×10~(-4)～1.0×10~(-2)mol/L谷氨酸浓度范围内,其动力学响应与谷氨酸浓度呈线性关系,相关系数为0.9586。计算得其Km值为7.13×10~(-3)mol/L,检测下限为3.0×10~(-4)mol/L,斜率为43mv/dec。该电极有良好的选择性。使用寿命可达一周以上。     

一种简单实用的谷氨酸浓度测定法

谷氨酸和茚三酮可以发生特有的显色反应 ,在 pH 5～ 6时产物蓝紫色最明显。其颜色深浅与谷氨酸浓度大小有关。用分光光度计可以在其最大光吸收波长处测定其OD值。分别以OD值和相应的一系列浓度的L谷氨酸纯品浓度值为纵坐标和横坐标 ,绘制出 1条标准曲线。谷氨酸发酵液中的谷氨酸含量值即可通过分光光度计测得它与茚三酮在最适 pH处反应得到的蓝紫色产物的OD值 ,然后从上述标准曲线上查到。误差率在 1 0 %左右。这为谷氨酸定量测定提供了一种简单实用的方法。     

天津短杆菌T6-13谷氨酸脱氢酶的研究

本文研究了天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)T6-13谷氨酸脱氢酶(GDH)[EC1.4．1．4]的纯化和性质。该酶以辅酶11(NADP)为其专一性辅酶,正、逆反应酶活力最适pH分别为7．5和8．9—9 9,对热较敏感。 该酶对还原型辅酶11(NADPH)、α-酮戊二酸(α-KG)、NH,、NADP和L-谷氨酸(GA)的Km值分别为0．076、3．23、4．0、0．02和120．48 mmol／L。该酶受反应产物的抑制,逆反应受NADPH、α-KG和NH+4的抑制,正反应受NADP和谷氨酸的抑制,但该酶所催化的逆反应既不受三羧酸循环代谢中间产物的抑制,也不受氨基酸的抑制和氨基酸的积累抑制。对发酵过程中谷氨酸脱氢酶活力变化的研究表明,前期酶活力逐渐上升,当发酵至16小时左右酶活力最高,其后酶活力逐渐下降;二级种子的酶活力与发酵过程中酶活力最高时相当。     

测蔗糖复合酶电极的研究

采用酶电极流动注射分析系统(EFIA),由固定化酶膜包括蔗糖转化酶(INV),葡萄糖变旋酶(MuT)及葡萄糖氧化酶(GOD)与氧电极共同组成的复合酶电极用于蔗糖的快速测定。实验确定每张酶膜的最适酶量(Iu比)为lNV：MUT：GOD：72：48：2．4。酶经固定化后,INV与MUT的综合回收活力>42．9％。其最适pH为5．8—6．5。最适温度范围是35—45℃。动态法和稳态法测试的线性范围分别为：5×10^-4—10^-1和10-5—2×10^-3mol／L,响应时间分别<20s和<2 min。实验的重复性良好,变异系数<1．7％。用此酶电极测定以蔗糖为碳源的发酵液中的蔗糖含量,平均回收率达到98％。发酵液中的蔗糖分解产生的葡萄糖对本电极的干扰可通过平行运行的GOD电极来校正。连续使用的寿命至少为120h。比前年报道的14th有了显著的提高。酶膜显示了较好的保存稳定性(30天,保存于4℃蒸馏水中)和一定的抗热性(50℃,30min)。     

一株产谷氨酸脱羧酶乳酸菌的鉴定及其酶学性质

从28株乳酸菌中筛选到了10株谷氨酸脱羧酶产生菌,其中以菌株Y-2的活性最高,当菌体(湿重)与1%谷氨酸一钠溶液按1∶10混合,于37℃反应12 h,转化液中γ-氨基丁酸浓度为14.52±0.93 mmol/L。通过形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株Y-2为唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus)。同时基于16S rDNA构建了系统进化树,并进行了系统发育分析。S.salivariussubsp.thermophilusY-2谷氨酸脱羧酶的粗酶最适反应温度和pH分别为45℃和5.0,在4~40℃和pH 4.75~5.25范围内较稳定,酶催化反应在0~6 h具有良好的线性。     

黑曲霉GD-6纤维素酶液体发酵条件的研究

采用黑曲霉 (Aspergillusniger)GD 6液体发酵生产纤维素酶 ,研究了碳源、氮源、培养基起始 pH值、接种量、摇床转速、通气量对该菌株产纤维素酶活力的影响。结果表明 ,GD 6的最适发酵温度为 2 8～ 3 0℃ ,产酶pH为 5 .5～ 6.0 ,摇床最适转速为 1 5 0r/min ,最佳接种量为 1 0 %。在以 6.0 %稻草粉为碳源、1 %豆饼粉为氮源时产酶活力最高。在最适培养条件下 ,发酵周期为 1 2 0h,发酵液中CMC酶活为 1 88.6U/mL ,FP酶活为 2 7.0U/mL。     

以二茂铁为中间介质的葡萄糖电极的研制

以二茂铁为中间介质的葡萄糖电极是由葡萄糖氧化酶、含有二茂铁的电极糊和铂金电极构成的。由于用二茂铁代替氧作为电子受体,故此电极的响应只取决于葡萄糖浓度,而与氧分压无关。该电极的稳态响应时间为40—120s,线性范围为0.6—16m mol/l。本文还讨论了各种因素(pH、温度、搅拌速度和一些基质)对电极的影响。用此电极对牛血清和发酵液中的葡萄糖含量进行测定并与酶法比较,结果令人十分满意。     

生产γ-氨基丁酸乳酸菌的选育及发酵条件优化

通过对食品安全级 (GRAS)乳酸菌的筛选 ,得到一株可高产谷氨酸脱羧酶的菌株。并且对菌株的发酵培养基与发酵条件进行了优化。结果表明 :采用优化后的培养基 ,调初始pH为 7.0 ,在 33℃进行发酵培养 3d后 ,发酵液中GABA含量可达到31 0g·L-1 以上 ,比优化前提高了约 4倍     

林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分性质的研究

以林生山黧豆为材料,利用硫酸按分段盐析,丙酮沉淀,DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析,SephacrylS300凝胶过滤柱层析及FPLC-MonoQ柱层析技术,以聚酰胺薄膜层析荧光定量法为酶活力检测手段,分离纯化了谷氨酸脱羧酶,达到电泳银染纯．纯化后的林生山黧豆谷氨酸脱羧酶活力达375．09U·mp-1,纯化倍数38．2倍,经SDS-PAGE测定,其亚基分子量为70kD,经梯度PAGE确定,天然分子量为140kD,表明该酶是由两个亚基组成的二聚体．酶学研究表明,纯化的林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的最适pH值为5．4,对谷氨酸的Km值为1．62×10-3mol·L-1,酶的最适温度为40℃,酶特异性地使谷氨酸脱羧,不能使天门冬氨酸等其它氨基酸脱羧．     

谷氨酸发酵液絮凝除菌的研究

采用天然高分子聚合物壳聚糖为絮凝剂,对谷氨酸发酵液中菌体的絮凝作用及絮体处理进行了系统的研究,并进行了１０００１中间试验。结果表明,发酵液ｐＨ、壳聚糖用量是影响絮凝效果的主要因素。ｐＨ５．５～６．５,壳聚糖用量３０×１０^－３ｇ／ｌ,温度３０～３５℃,搅拌转速２０ｒ／ｍｉｎ,搅拌１～２ｍｉｎ,可获得良好的絮凝效果。１０００１中试结果,除菌上清液低温等电点提取谷氨酸收率８３％,谷氨酸纯度９１．３％,谷氨酸总收率８０．２６％。壳聚糖对谷氨酸发酵液和等电点母液中的菌体均有良好的絮凝作用。     

甘油氧化酶发酵条件及酶学性质的研究

日本曲霉 (AspergillusjaponicusAj113)发酵生产甘油氧化酶 (GlycerolOxidaseEC 1 1 3 - )的最适产酶条件 :初始pH 6 0- 6 5 ,温度 2 9± 1℃ ,培养时间 36h ,5 0 0ml三角瓶发酵液的装量为 10 0ml;酶的最适作用pH为 5 0 ,该酶在pH9 5 ,温度 30℃以下时稳定性较好 ;0 0 5mol L的硼砂 -碳酸钠缓冲液 (pH9 5 )对酶有较好的保存效果 ,Zn2 + 、Cu2 + 、Fe3+ 、Ca2 + 离子对酶有激活作用 ,Hg2 +离子对酶有强烈的抑制作用     

酵母菌产麦角固醇发酵条件的研究

为了提高酵母菌麦角固醇的产量,采用摇瓶培养法,对筛选出的一株酵母菌YN2产麦角固醇发酵条件进行了研究。结果表明,酵母菌YN2产麦角固醇适宜的培养基配方为：酵母粉1％,牛肉膏2．5％,葡萄糖8％,K2HPO4 0．3％,MgSO4 0．15％,该菌株产麦角固醇最适培养条件为：培养温度28℃,起始pH6．5,发酵时间72h。在优化的实验条件下,麦角固醇含量可达2．2％,100ml发酵液中麦角固醇产量达25．30mg。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶 (GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶 ,谷氨酸棒杆菌S91 1 4是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种 ,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶 ,研究其辅酶组成 ,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质 ,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、ED TA的Tris_HCl缓冲液 (pH 7 5 )洗涤 ,用Frenchpressurecellpress破碎 ,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用 KTA_10 0快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱 (HIC)、G_2 0 0凝胶过滤柱层析得到纯化大约 70倍的以NAD PH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一 ,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为 188kD和 32kD ,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHIU_30 0 0分光光度计利用NAD(P)H在 340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford方法进行 ,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S91 1 4中确实存在两种GDH ,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样 ,S91 1 4可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢 ,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。     

黑曲霉糖化酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadez G—150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS 3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶(GI、Gill、GII)。其收率分别为0.8％、50％和18．6％。GI、Gill和GII的分子量分别为27000、67000和53000;等电点分别为3.38、3.52和3．59;含糖量分别为8．7％．13．6％和18．3％;最适pH分别为4.4、4．6和4.6;对可溶性淀粉的Km值分别为2．0、0．77和1．18g／L;二级结构中a-螺旋含量分别为18．4％、23．9％和28．9％;最适温度均为70℃。生淀粉可吸附Gill,吸附率达80％。此外还测定了三种同工酶的氨基酸组成及含量。GI、GII和GIII均由一条多肽链组成。     

多粘杆菌β-淀粉酶的产生及其性质的初步研究

多粘杆菌(Bacillus polymyxa) As1.546产β-淀粉酶的最适培养基成份(％)为：玉米粉4,豆饼粉2,酵母膏0.5,Na HPO4·12H2O 0．2,NaH2PO4·2H2O 0．03,MgSO4．7H2O 0．05,自然pH(7左右)。250毫升三角瓶装50毫升培养基,旋转式摇床(220转／分),温度为30a℃,培养时间为60小时,每毫升发酵液酶活力可达700单位。酶反应的最适温度为45℃,最适pH为6．5,水解可溶性淀粉生成麦芽糖可达96％。     

利用内源元件在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶

以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD)序列,构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达,选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽,分别为Tat型的CgR0949及Sec型的CspB信号肽。在实现分泌表达之后,对其进行5 L发酵罐的扩大培养以提高分泌量。并对纯化的木聚糖酶进行了部分酶学性质的研究,包括最适催化pH及酸碱耐受性;最适催化温度及热稳定性。结果表明:在上述表达体系中,以CgR0949为信号肽木聚糖酶不能分泌到胞外;木聚糖酶能在CspB信号肽的引导下分泌到胞外,分泌表达量为486.2 U/mL。木聚糖酶的分泌量在5 L发酵罐水平上达到1 648.7 U/mL,是摇瓶培养的3.4倍。该木聚糖酶的最适反应pH为4.5,最适温度为45℃;在pH 4–11范围内4℃处理24 h酶活保持在80%以上;在50℃前处理15 min酶活保持在95%以上,超过60℃则酶活迅速下降至20%及其以下。上述结果表明,谷氨酸棒杆菌内源元件能有效用于木聚糖酶的分泌表达,扩大培养能进一步提升木聚糖酶的分泌量。该双顺反子表达体系能为外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达提供一种可用的工具。此外,通过酶学性质的研究可进一步提高木聚糖酶的催化效率。