人凝血因子IX突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子IX(hFIX)基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血。文章综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型。其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应。最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型(第338位Arg→Ala),并对其应用作了展望。     

人凝血因子IX突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子IX（hFIX）基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血。本文综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型。其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应。最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型（第338位Arg→Ala）,并对其应用作了展望。     

微小腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应, 延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间, 制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ, 同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照. 经CsCl超离心纯化, AdGTi’Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8%. 分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞, hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3) μg/(10⁶∙24 h)和(1.4±0.2) μg/(10⁶∙24 h). 血友病B小鼠分别腹腔注射1×10¹⁰ pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ, 小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690 ng/mL, 表达时间分别持续了16和10周. 与血友病B小鼠相比, 出血时间从原来的超过30 min缩短到7.5 min, 5 min内失血量从原来的430 μL减少到60 μL. 免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明, 微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比, 在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低. 结果表明, 微小腺病毒与第1代腺病毒相比, 同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达, 而且在动物体内的表达时间上有所延长, 病毒引起的免疫反应强度则明显降低, 为进一步的研究提供了实验依据.     

微小腺病毒介导的人凝血因子IX基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应,延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间,制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ,同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照。经CsCl超离心纯化,AdGTi‘Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8％。分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞,hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3)μg/(10~6·24h)和(1.4±0.2)μg/(10~6·24h)。血友病B小鼠分别腹腔注射1×10~(10)pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ,小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690ng/mL,表达时间分别持续了16和10周。与血友病B小鼠相比,出血时间从原来的超过30min缩短到7.5min,5min内失血量从原来的430μL减少到60μL。免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明,微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比,在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低。结果表明,微小腺病毒与第1代腺病毒相比,同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达,而且在动物体内的表达时间上有所延长,病毒引起的免疫反应强度则明显降低,为进一步的研究提供了实验依据。     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术, 将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因, 并构建于AAV载体上, 以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒, 然后, 经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验, 观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果. 结果显示: (i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在, 并持续15周以上; (ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%, 显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%); (iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在; (iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用. 提示: 以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFIX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

人凝血因子ⅨcDNA在C2C12成肌细胞及C3H小鼠中的高效表达

以小鼠C2C12成肌细胞为对象开展血友病B基因治疗研究.除已有的XLIX,LNCIX和GlNaCIX反转录病毒载体外,又首次将微小MCK(muscle creatinekinase)增强子顺序构建到hCMV(human cytomegalovirus)启动子上游,共同控制FIXcDAN的转录.用带有上述4种载体的病毒悬液分别感染C2C12细胞后,ELISA检测结果发现,FIX蛋白离体表达水平为:G1NaMCIX>GlNaCIX>LNCIX>XLIX.其中C2C12/G1NaMCIX混合克隆高达640ng/(10~6细胞·24h).C2C12/G1NaMCIX细胞注射C3H小鼠后肢骨骼肌肉组织,人FIX蛋白持续表达35d,其中最高表达峰达206ng/mL血浆.此结果对于研究FIX cDNA在脱细胞中的表达调控以及采用成肌细胞移植途径开展血友病B基因治疗研究有重要意义.     

利用烟草表达人凝血Ⅸ因子(hFIX)的研究

血友病B是凝血Ⅸ因子(hFIX)缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血Ⅸ因子对血友病B治疗具有重要意义.植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势.为此,构建含人凝血Ⅸ因子基因(hFIX,2.8kb)植物双元表达载体p35s-2300∷gus∷noster,用农杆菌介导法转化烟草"百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株,hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1～4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5～8.8ng/g·FW,并具有免疫活性.为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考.     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ结合蛋白家族的研究进展

凝血因子Ⅸ/Ⅹ结合蛋白家族是近来发现的C型动物凝集素超家族中一个亚家族.它们存在于蝰科蛇毒中,不具有酶活性,通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合来延长凝血时间.在钙离子存在下结合在凝血因子Ⅸ/Ⅹ分子中γ-羧基谷氨酸区域.它们彼此之间具有很高的序列同源性,都是由两条同源的肽链通过一对二硫键相连.两条肽链都具有C型糖识别区的二硫键构型,各含一个钙离子结合位点.其中habu凝血因子Ⅸ/Ⅹ结合蛋白的晶体结构已经测定,除掉相互交叠的中心环外,两条肽链都具有类似于鼠甘露糖结合蛋白的结构.     

重组人活性凝血因子Ⅶ及其应用

人凝血因子Ⅶ(FⅦ)是一种维生素K依赖的单链糖蛋白,在体内凝血过程中发挥着重要的作用。重组人活性凝血因子Ⅶ(rhFⅦa)在血管损伤处与组织因子结合后产生足够的凝血酶,从而触发凝血瀑布。rhFⅦa于1999年由美国FDA批准上市(Novo Seven),尽管结构与血浆提取的FⅦa存在差异,但两的功能是完全一致的。临床研究表明,rhFⅦ对血友病、血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的止血效果。rhFⅦa由于安全有效,成为治疗血友病、外科创伤出血等的替代疗法。     

血友病B的基因治疗

血友病B是一种凝血Ⅸ因子缺陷引起的X连锁隐性遗传的出血性疾病 .近年来 ,国内外学者在基因治疗方面取得的大量研究成果给血友病B患者带来了根治疾病的希望 .就血友病B的基因治疗研究进展及所存在的问题作一综述 .     

应用荧光原位杂交检测人凝血因子Ⅸ在转基因小鼠染色体上的整合

应用荧光原位杂交（FISH）技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4代的整合情况。阳性转基因小鼠98%~100%的中期分裂相,85%~94%的间期核出现杂交信号;阴性对照小鼠100%的中期分裂相、95%~96%的间期核未出现杂交信号。结果表明,该FISH实验条件能对转基因整合位点进行高效特异检测。本文分析的两家系转基因小鼠均为单位点整合, 但整合位点不同。各家系内F1到F4代的转基因小鼠均可检出整合染色体,且整合位点相同,表明外源基因稳定整合并遗传给后代。 Abstract:Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to detect the integration of hFⅨ on chromosomes of transgenic mice from F1 to F4 generation in two strains.For transgenic mice,98%~100% of metaphases and 85%~94% of interphases showed hybridization signal.For negative control mice,100% of metaphases and 95%~96% of interphases showed no hybridization signal.The results demonstrated that FISH developed to detect the integration sites of hFⅨ was high efficient and specific.The integration sites of the transgenic mice analyzed were both single but different between the two strains.The integration chromosomes can be found in the transgenic mice from F1 to F4 generation and the integration sites were the same as each of the strains,which indicated that the transgene was stably integrated and transmitted to offspring.     

人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析

目的通过比较以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrates,PCC)过程中凝血因子活化情况,为选择最适PCC制备原料提供数据支持。方法分别对以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备PCC过程中中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目进行检定,分析凝血因子的活化情况。观察以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC过程中添加肝素能否抑制PCC中凝血因子的活化。结果以组分Ⅲ沉淀为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均不合格。以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC生产过程中添加肝素后,PCC中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性均不合格。以血浆为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均合格。结论组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC会增加凝血因子活化的风险,新鲜冰冻血浆可作为制备PCC的原料。     

基于凝血因子IX基因剔除小鼠建立血友病乙转基因动物模型

为在凝血基因IX基因剔除小鼠基础上建立基因组中整合有含特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体原转基因小鼠家系,为血友病乙的研究提供更接近临床实际的动物模型。利用体外定点突变技术,构建含有特定点突变的人凝因IX基因表达载体,该载体包括由人凝血因子IX编码区及第一内含子构成的人凝血因子IX基因（hFIXml）、4个拷贝的MCK增强子（MCKe）、鸡β－肌动蛋白启动子（bA）及PolyA,命名为pMe4bAIXml质粒。将其线性化后,用显微注射法注射入817只凝血因子IX基因剔除小鼠受精卵雄原核,再将它们分别回输45只假孕受体母鼠的输卵管中,共产仔69只,存活63只。采用PCR与基因组Southern杂交筛选法鉴定小鼠,证实6只小鼠基因组中整合有含特定点突变的pMe4bAIXml质粒,并对1只小鼠的PCR产物进行测序,证实转基因结构特征符合设计要求。     

长效重组人凝血因子Ⅷ研究现状及进展

重组凝血因子Ⅷ(rFⅧ)替代疗法是目前临床上治疗A型血友病最为有效的方法。过去十几年的临床试验已经验证了rFⅧ替代疗法的安全性和有效性,但由于FⅧ的半衰期较短,患者需要隔天或者每周3次进行静脉注射治疗。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦,还容易产生FⅧ抗体,严重影响治疗效果。以下就目前长效型重组凝血因子Ⅷ的研究进展及存在的主要问题进行了综述。     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

凝血因子Ⅷ

人凝血因子Ⅷ(抗血友病因子)是凝血内部级联途径(intrinsic clottingcascade)中起重要作用的血浆糖蛋白。A型血友病或称古典血友病是由于不正常的凝血因子Ⅷ引起的,10万名男性中发病率约为10—20人。近十年来,人们关于凝血因子Ⅷ,特别是它的基因和蛋白分子结构方面的知识日益增加。这篇综述总结了人凝血因子Ⅷ的结构和基因的分子克隆以及血友病的遗传诊断及治疗方面的新进展。     

人凝血Ⅸ因子cDNA在培养细胞中和转基因小鼠内的表达特性

将由ＳＶ４０早期启动子和小鼠金属硫蛋白基因启动子所控制的人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ的重组基因分别导入培养的小鼠成纤维细胞,发现它们都能被表达。进而将它们分别导入小鼠受精卵雄原核,作成相应的转基因小鼠,则发现它们都失去了表达特性,结果分析表明,在人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ中可能存在着决定其在活体内表达的顺式调节元件。