菜豆环氧化物水解酶的表达及其催化特性研究

【背景】光学纯环氧化物及邻二醇是一类多功能手性砌块。与化学合成法相比,环氧化物水解酶(EHs)介导的生物转化法因环境友好而成为当前的研究热点。【目的】从菜豆(Phaseolus vulgaris)中克隆一种EH基因并进行原核表达,研究重组酶催化环氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的水解特性。【方法】通过计算机辅助分析EHs的一级结构,推测一种菜豆来源的未知功能蛋白(PvEH4)可能具有EH活性。利用RT-PCR技术,以菜豆总RNA为模板,扩增编码PvEH4的基因pveh4,并实现其在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达。利用重组菌E.coli/pveh4全细胞催化SO水解,分析PvEH4的对映选择性和区域选择性。【结果】一级结构分析表明,PvEH4具有α/β折叠型EH特有的保守区域。SDS-PAGE结果显示PvEH4的表观分子量为39.4 kD。PvEH4针对SO的对映选择率(E值)为10.1,区域选择性系数αS和βR分别为99.5%和82.5%。当外消旋SO转化率达到68.1%时,可同时获得99.9%ees的(R)-SO和92.3%eep的(R)-苯乙二醇(Phenyl-1,2-ethanediol,PED),两者的产率分别为31.9%和65.6%。【结论】PvEH4的挖掘不仅增加了植物类EHs的数量,同时也为EHs的蛋白分子改造提供参考。     

定点突变改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化特性

环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(Pv EH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对Pv EH1进行改造,以期改善Pv EH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明Pv EH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1~(L105I)和E.coli/pveh1~(V106I)对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高;L105I和V106I位组合突变菌株E.coli/pveh1~(L105I/V106I)的催化活性(493.8U/g湿细胞)是E.coli/pveh1的3.1倍,对映选择性(E=8.3)也提高至E.coli/pveh1的1.5倍。纯化后Pv EH1~(L105I/V106I)的催化活性为17.6U/mg,是Pv EH1的1.5倍,对1a的催化效率提高至Pv EH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白质的可溶性表达量。利用E.coli/pveh1~(L105I/V106I)全细胞催化100mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯(R)-1a(ee96%)的产率和时空产率分别为31.2%和5.12g/(L·h),因此,在手性纯(R)-1a的制备中,E.coli/pveh1~(L105I/V106I)是一种颇具潜力的生物催化剂。     

定点突变提高环氧化物水解酶AuEH2催化对甲基苯基缩水甘油醚的对映选择性*

环氧化物水解酶可催化外消旋环氧化物的动力学拆分或对映归一性水解制备手性环氧化物或邻二醇,具有广阔的应用前景.为提高宇佐美曲霉环氧化物水解酶 (AuEH2) 催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚 (rac-pMPGE) 的对映体选择率 (E).通过分子动力学模拟 (MD) 选取相互作用频率最高的位点A250替换为其他19种氨基酸;选取对映选择性显著提高的突变体测定其动力学参数 (K_m和k_cat) 及区域选择性系数 (β_S和β_R),并利用重组大肠杆菌全细胞拆分rac-pMPGE.突变体AuEH2^A250H的E值从12.7提高至38.4,重组菌比活力为51.9U/g湿细胞;其水解 (S)-pMPGE的k_cat/K_m从10.0mmol/(L·s)提高至12.8 mmol/(L·s),而水解 (R)-pMPGE的k_cat/K_m从1.13mmol/(L·s)降低至0.35mmol/(L·s);全细胞拆分20mmol/L rac-pMPGE获得 (R)-pMPGE的ee_s为>99%,产率从33.0% 提高至40.7%.A250位点的突变对AuEH2的对映选择性和酶活力具有显著影响;高对映选择性的AuEH2突变体在制备高光学纯的 (R)-pMPGE中具有应用潜力.     

黄荆中β-石竹烯对棉蚜的毒力和作用机理

为明确泰山野生黄荆Vitex negundo种子中的有效杀虫活性成分、杀虫作用及其毒理机制,本研究采用硅胶柱层析,GC-MS技术和生物活性追踪方法,测定了泰山黄荆种子中的杀虫活性成分;采用生物测定和生化分析法,研究了黄荆中的β-石竹烯和α-蒎烯对棉蚜Aphis gossypii的毒力及作用机制。结果表明：通过三级柱层析从黄荆中分离得到对棉蚜毒力高的馏分β-石竹烯和α-蒎烯,其含量分别达7.68%和5.45%。β-石竹烯和α-蒎烯对棉蚜的触杀毒力都较高,并以β-石竹烯的毒力最高,LD₅₀为0.65×10^-1 μg/头。β-石竹烯和α-蒎烯对棉蚜均具有强烈的忌避作用,处理棉蚜24 h的AFC₅₀分别为0.80×10³和0.89×10³ mg/L,其中也以β-石竹烯的忌避毒力最大。β-石竹烯和α-蒎烯以亚致死剂量处理棉蚜,对其繁殖力、排蜜频率和排蜜量均有显著不利影响。β-石竹烯和α-蒎烯处理棉蚜或离体酶,对乙酰胆碱酯酶、多酚氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶都有明显抑制作用。结果显示β-石竹烯和α-蒎烯是黄荆种子提取物中的重要杀虫活性成分,并且其致毒机制存在多样性,开发应用价值大。     

新颖微生物低温酯酶EstP8的酶学性质研究与在手性催化中的应用

从假单胞菌Pseudonocardia antitumoralis HUP007基因组中克隆了一个1 041bp的酯酶基因EstP8,编码的蛋白具有377个氨基酸残基。在E.coli BL21（DE3）中实现酯酶EstP8的高效异源表达和纯化。EstP8为脂肪酶家族Ⅳ中的一员,具有HGGG保守序列。EstP8最适底物为对硝基苯酚乙酸酯（p-NPO）,最适温度和pH分别为50℃和8.0。EstP8催化p-NPO水解反应的活性、V_max和K_m分别达到105.19U/mg、89.4μM/min、1.144mM。EstP8在pH7.0~8.0范围内具有良好的pH稳定性;在4℃时,酯酶相对活力为41.78%,在10~40℃内具有很好温度稳定性。EstP8对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对该酶的活性有激活作用。辛烷、庚烷、甲苯、丙酮、DMF等有机溶剂对EstP8的活性同样具有激活作用。酯酶EstP8还可以通过水解拆分高效地制备手性（R）-1-苯基乙醇;添加有机溶剂可以很好地促进该酯酶的光学选择性和产率,在共溶剂甲苯的存在下,所制备的（R）-1-苯基乙醇的e.e.和产率可达91%和18%;在共溶剂DMSO的存在下,所制备的（S）-乙酸苏合香酯的e.e.和产率可达98%和60%。酯酶EstP8在手性生物催化等诸多工业领域有很好的应用潜力。     

恶臭假单胞菌CGMCC 1388对映选择性生物降解制备(S)-扁桃酸及其衍生物的研究

从土壤中分离得到一株（R）-扁桃酸选择性降解菌,经鉴定为恶臭假单胞菌,保存于中国普通微生物保藏中心,编号为CGMCC1388。考察了扁桃酸及其降解产物对扁桃酸脱氢酶活力的影响。研究表明,在培养基中添加少量扁桃酸、苯甲酰甲酸或苯甲酸均可显著提高其产量,以扁桃酸的诱导效果最佳。3种诱导物的最适添加质量浓度分别为4、4和2 g/L。当以消旋扁桃酸为反应底物时,该菌可高选择性降解（R）-扁桃酸,回收得到的（S）-扁桃酸对映体过量值（e.e.）高于99%,反应的对映选择率（E）达130。用静息细胞催化扁桃酸降解的最适温度和pH分别为30 ℃和6.0,最适底物浓度为60 mmol/L,以双倒数法求得Km为47 mmol/L。考察了该菌对扁桃酸苯环取代衍生物的生物转化,并以高产率制备获得高对映纯度的（S）-对羟基扁桃酸和（S）-对氯扁桃酸。     

脂肪酶YCJ01拆分对位取代α-苯乙醇

利用脂肪酶YCJ01催化拆分对位取代α-苯乙醇衍生物。以异丙醚为反应介质,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体,对180 mmol/L的1-(4-甲基苯基)乙醇进行选择性酯化,脂肪酶粗酶粉添加量为5 g/L,50℃反应21 h后,底物转化率可达49.96%,对映体过量值e.e.s、e.e.p值分别为97.1%和97.2%,对映体选择性E200;同样,对1-(4-甲氧基苯基)乙醇进行选择性酯化,酰基供体为丁酸乙烯酯,底物浓度150 mmol/L,脂肪酶粗酶粉添加量为2.5g/L,30℃反应12 h后,底物转化率为49.8%,e.e.s、e.e.p值分别为97.7%和98.4%,对映体选择性E200,显示了很好的手性拆分效果。     

微生物环氧化物水解酶的研究进展

环氧化物水解酶(EH)是一类能催化外消旋环氧化物水解生成有光学活性的环氧化物和二醇的酶,应用前景广阔。自然界筛选到的微生物往往存在产酶活力低、对映体选择性不高等问题。近年来,基因工程技术的发展及其在微生物环氧化物水解酶中的应用,改善了酶的催化特性,为酶的工业化应用提供了条件。该文简单介绍了微生物环氧化物水解酶的催化反应机制和快速检测方法,详细介绍了环氧化物水解酶基因工程方面的研究进展。     

白龙江干旱河谷不同坡向主要灌丛群落随海拔梯度变化的物种多样性研究

采用样方调查法,研究了白龙江干旱河谷不同坡向主要灌丛群落沿着海拔梯度的结构特征、物种多样性的变化规律,旨在了解白龙江干旱河谷不同海拔梯度植被特征和物种多样性变化,为白龙江干旱河谷区域不同海拔植被恢复提供理论依据。研究结果表明：（1）不同海拔梯度同一坡向物种数不同,同一海拔不同坡向物种数也不同,随着海拔的升高不同坡向物种数表现为先增加后减少的趋势,同一海拔梯度内不同坡向主要植被类型也不同。（2）主要灌木群落α多样性在不同坡向随着海拔梯度的升高,表现出先升高后减小的趋势。不同坡向草本群落α多样性随着海拔的升高,也表现出先升高后减小的趋势。对主要灌丛α多样性指数进行相关性分析得物种丰富度指数对物种多样性贡献率最大,表现为丰富度指数（D₁、D₂）> 生态优势度指数（SN）> 种间机遇指数（H）> 群落均匀度指数（R）。（3）不同坡向主要灌丛群落β多样性Whittaker指数沿着不同海拔梯度变化不大,最大值出现在海拔1250~1650m;Routledge和Codyβ多样性指数在海拔1450~1650m出现最大值,但是大体呈现出波形变化。草本β多样性随着海拔的升高变化较大,阳坡植物的β多样性指数在海拔1050~1250m达到最大,阴坡和半阴半阳坡在海拔区间1250~1450m达到最大,半阴半阳坡的β多样性指数均大于阳坡。白龙江干旱河谷不同坡向、不同海拔梯度物种α多样性和β多样性都不同,且不同坡向随着海拔梯度的变化物种α多样性和β多样性呈一定的相关性,说明海拔和坡向是影响生物多样性主要因子之一。     

高对映选择性环氧化物水解酶产生菌的筛选及特性研究

从土壤中分离的芽孢杆菌Bacillus megaterium ECU1001所产五氧化物水解酶能高对映选择性水解缩水甘油苯基醚（对映选择率E值可达47.8）,当转化率为55.9%时,剩余的（S）－缩水甘油苯基醚的光学纯度（对映体过量值,ee）可达99.5%;当底物浓度提高到60mmol/L时,光学纯（S）－缩水基油苯基醚的收率达到25.6%。     

中国九省（区）农民超重肥胖的变化趋势及人口经济因素的影响

目的：分析1991—2015年我国18~64岁成年农民超重肥胖的变化趋势,并探讨人口经济因素对其的影响。方法：利用“中国健康与营养调查”1991—2015年间9轮队列研究的基本信息、社会经济因素和体格测量数据,选择18~64岁职业为“农民、渔民或猎人（以下简称农民）”的成年人作为研究对象。采用《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》中的体质指数（BMI）切点值判定肥胖程度。应用多因素Logistic模型分析人口经济因素对肥胖发生危险性的影响。结果：1991—2015年间,我国农民超重和肥胖率均呈逐渐上升趋势,超重率从11.42%上升至35.80%,肥胖率从1.37%上升至13.92%。多因素Logistics分析结果显示,女性超重肥胖危险性高于男性。随着年龄的增加,农民超重肥胖危险性明显增加,35~49岁、50~64岁年龄组肥胖危险性高于18~34岁年龄组。北方及中部地区农民超重肥胖危险性高于南方地区。高收入水平的农民超重肥胖危险性高于低收入水平的农民。高中及以上文化程度的农民超重肥胖危险性高于小学及以下组。结论：性别、年龄、收入水平、地理位置是农民超重肥胖的重要影响因素。建议根据分布特征,将优质资源集中到中部、北方地区,并加强对中老年人进行营养知识和健康生活方式的宣教。同时也要关注高收入地区及男性农民的超重肥胖问题。     

地山雀血红蛋白高原低氧适应的分子机制

血红蛋白(hemoglobin,Hb)作为血液循环系统中氧气运输的主要载体,在动物高原低氧适应中发挥关键作用.本文结合基因组、转录物组、分子进化、同源建模和分子动力学计算等分析,探索了高原土著鸟类地山雀血氧亲和力升高的分子机制.结果表明,与大山雀相比(RPKM为0),胚胎特异表达ρ基因在地山雀成体肝中表达较高(RPKM...     

Cloning and characterization of an epoxide hydrolase from Cupriavidus metallidurans-CH34

A putative epoxide hydrolase-encoding gene was identified from the genome sequence of Cupriavidus metallidurans CH34. The gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli with His(6)-tag at its N-terminus. The epoxide hydrolase (CMEH) was purified to near homogeneity and was found to be a homodimer, with subunit molecular weight of 36 kDa. The CMEH had broad substrate specificity as it could hydrolyze 13 epoxides, out of 15 substrates tested. CMEH had high specific activity with 1,2-epoxyoctane, 1,2-epoxyhexane, styrene oxide (SO) and was also found to be active with meso-epoxides. The enzyme had optimum pH and temperature of 7.5 and 37°C respectively, with racemic SO. Biotransformation of 80 mM SO with recombinant whole E. coli cells expressing CMEH led to 56% ee(P) of (R)-diol with 77.23% conversion in 30 min. The enzyme could hydrolyze (R)-SO, ～2-fold faster than (S)-SO, though it accepted both (R)- and (S)-SO with similar affinity as K(m)(R) and K(m)(S) of CMEH were 2.05±0.42 and 2.11±0.16 mM, respectively. However, the k(cat)(R) and k(cat)(S) for the two enantiomers of SO were 4.80 and 3.34 s(-1), respectively. The wide substrate spectrum exhibited by CMEH combined with the fast conversion rate makes it a robust biocatalyst for industrial use. Regioselectivity studies with enantiopure (R)- and (S)-SO revealed that with slightly altered regioselectivity, CMEH has a high potential to synthesize an enantiopure (R)-PED, through an enantioconvergent hydrolytic process.     

黑曲霉生产β-葡萄糖苷酶发酵条件的研究产

经多项式回归分析,研究了不同浓度N源、C源、无机盐等对酶产量的影响,确定出最佳培养基配方为:麸皮4.9%,(NH₄)_2>SO₄0.4%,KH₂PO₄0.29%,CaCl₂0.05%,MgSO₄·7H₂O0.04%,FeSO₄·7H₂O 5mg·L^-1,ZnCl₂1.4mg·L^-1,0.2%油酸钠。并对培养温度、时间、培养基初始pH、通气量、接种量、接种方式等培养条件进行优化,使黑曲霉生产β葡萄糖苷酶的产量由17U·ml^-1增至21.3U·ml^-1.     

不同光环境下栓皮栎和刺槐叶片光合光响应模拟

植物的光合作用在一定程度上能够体现其对生境的响应情况.采用Li-6400XT光合测定系统,测定了黄河小浪底森林生态系统定位研究站栓皮栎和刺槐人工林林内、林缘叶片气体交换的光响应曲线,利用叶子飘模型对光合作用-光响应进行了拟合,分析了林内和林缘光合参数的差异,将气孔导度机理模型与光合作用-光响应修正模型进行耦合,研究了气孔导度(g_s)的光响应特征.结果表明: 7-8月,当光强小于200 μmol·m^-2·s^-1时,林内栓皮栎叶片净光合速率(P_n)高于林缘叶片,初始量子效率(α)高于林缘叶片12.4%,林内栓皮栎叶片对弱光的捕获和利用能力明显高于林缘叶片;当光强大于200 μmol·m^-2·s^-1时,林缘栓皮栎叶片光合能力P_n高于林内.低光强下(0~200 μmol·m^-2·s^-1),林内刺槐叶片P_n高于林缘;当光强大于200 μmol·m^-2·s^-1时,林内刺槐叶片P_n低于林缘,且暗呼吸速率(R_d)和光补偿点(I_c)分别低于林缘50.0%和42.8%,以此来减少碳损耗,适应较低的光合速率.林内和林缘刺槐g_s随光强的变化差异显著.栓皮栎和刺槐叶片对不同光环境具有较强的适应能力.栓皮栎叶片的最大净光合速率(P_{n max})和α主要受气孔导度控制,R_d和I_c主要受气温影响.刺槐叶片的P_{n max}和α均与气温呈显著正相关,I_c、光饱和点(I_s)与叶片饱和水汽压差呈显著正相关.     

Seed Storage Glutelin α-2 Subunit Lacking Mutants in Rice

Nine rice Oryza sativa L.） mutant lines lacking the seed storage glutelin α-2 subunit were obtained from the progenies of fertilized egg cells treated with N-methy-N-nitrosourea (MNU). The mutants could be classified into three types: the α-1 subunit increased type (α-1H/α-2L), decreased the β-2 subunit decreased type (β-2L/α-2L) and the α-3 subunit increased type (α-3H/α-2L) according to their SDS-PAGE profiles. Two-dimensional electrophoresis analysis revealed that all of the mutants lacked a polypeptide of pI 6.71/α-2, while new polypeptides of pI 6.50/α-1 and pI 6.90/α-3 formed in α-1H/α-2L and α-3H/α-2L mutants respectively. Although the β-2L/α-2L mutants did not form new polypeptide, their pI 8.74/β-2 polypeptide was also decreased, suggesting that the two polypeptides decreased in β-2L/α-2L mutants might derive from the same glutelin precursor. These mutant lines are very useful in studying genetic characterisation,the mechanism of genetic regulation on biosynthesis, gene function and proteomics of rice seed storage glutelin.     

KLFs对珠蛋白基因表达和红系分化的调控作用

Krüppel样因子(Krüppel-like factors, KLFs)是一组与真核基因转录调控密切相关的锌指蛋白.KLFs高度保守的羧基末端含3个串联的Cys2His2型锌指结构,用于结合GC盒和CACCC盒等DNA序列. 红细胞中特异表达的珠蛋白基因和许多红系调控因子中都含有CACCC盒.已有研究发现,多个KLFs通过结合CACCC盒参与调控珠蛋白基因表达和红系分化,例如,KLF1通过结合β-珠蛋白启动子和位点控制区(locus control region, LCR),促进β-珠蛋白的表达、γ-向β-珠蛋白基因的转换和红系分化;KLF2、KLF11和KLF13分别促进ε-和γ-珠蛋白基因的表达;KLF4促进α-和γ-珠蛋白基因的表达;KLF3和KLF8则抑制ε-和γ-珠蛋白基因的表达. 本文综述了KLFs调控珠蛋白基因表达和红系分化的研究进展.     

温度对温带和亚热带森林土壤有机碳矿化速率及酶动力学参数的影响

研究了温度对长白山阔叶红松林、鼎湖山常绿阔叶林2个不同纬度的森林土壤有机碳矿化速率和酶动力学参数的影响.结果表明:土壤有机碳矿化速率(C_min)随着温度的增加而增加,长白山土壤C_min及其温度敏感性(Q_10(Cmin))显著高于鼎湖山土壤.长白山土壤β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)的酶动力学参数潜在最大反应速率(V_max)和半饱和常数(K_m)高于鼎湖山土壤,但鼎湖山土壤的催化效率(V_max/K_m)高于长白山土壤,表明随着温度的升高,土壤βG和NAG的V_max和V_max/K_m增加,K_m降低,即酶与底物的结合程度增加.鼎湖山土壤βG的Q_10(Vmax)、Q_10(Km)高于长白山土壤,这与土壤Q_10(Cmin)结果不一致.增温对长白山和鼎湖山森林土壤有机碳矿化及酶动力学参数的影响机制不同,在土壤生物化学过程对增温响应的模型中应区别考虑.     

腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达

腈水合酶由α亚基和β亚基组成,活化元件对其功能表达至关重要,研究腈水合酶基因簇中各元件的表达比例对酶重组表达的影响具有重要意义。以来源于Klebsiella oxytoca KCTC 1686的腈水合酶（NHaseK）为研究对象,构建了多种表达策略,以期实现α亚基、β亚基和活化元件17k差异表达。利用pETDuet-1质粒具有双T7启动子的特点,将上述基因以八种不同的组合方式分别插入于两个启动子之后。当将三段基因同时插入于第一个启动子之后时,亚基表达量均衡,比活力为0.78 U/mg蛋白,是亚基表达量比例为5：3时的124%。在此基础上,在第二个启动子之后插入活化元件基因,活化元件表达水平提升2倍,比活提升5%,为0.82 U/mg蛋白。当将α亚基和β亚基插入于不同启动子之后时,酶活仅为对照组的10%,说明NHaseK的亚基必须同时转录才可形成成熟蛋白。进一步考察质粒拷贝数对大肠杆菌表达NHaseK的影响,确定15~20的质粒拷贝数足够实现NHaseK的功能表达。结果表明,亚基的均衡表达以及活化元件的充分表达对NHaseK的重组表达具有积极作用。