尿酸影响人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中BMP-2 表达

目的:探讨在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)成骨分化过程中,不同浓度尿酸(UA)对骨形态形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响。方法:以全骨髓贴壁培养法分离h BMSCs,将生长状态良好的第3代h BMSCs分为5组,分别为空白对照组(加入完全培养基)和成骨诱导组(加入成骨诱导液及含0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L尿酸的完全培养基)。连续干预诱导14d后,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,通过观察茜素红染色情况及检测碱性磷酸酶(ALP)活性进行成骨情况的检测。RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2 mR NA的表达情况。结果:第3代h BMSCs大多为形态单一的长梭形,呈旋涡状生长;干预诱导后的细胞逐渐变成不规则的立方形,局部形成团块状结节,以含尿酸浓度为0.8 mmol/L的成骨诱导培养基最为显著。连续干预14d后,空白对照组茜素红染色为阴性,而各成骨诱导组细胞茜素红染色结果为阳性,提示干预诱导后的细胞为成骨细胞。碱性磷酸酶活性随尿酸浓度的增加和干预时间的延长而增强(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,空白对照组无BMP-2 mR NA的表达。成骨诱导组随培养基中尿酸浓度的增加,BMP-2 mR NA表达逐渐增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:尿酸上调h BMSCs向成骨细胞分化过程中BMP-2 mR NA的表达。     

miRNA在人骨髓来源间充质干细胞软骨诱导分化过程中的表达

目的：研究miRNAs在人骨髓来源间充质干细胞软骨诱导分化过程中的表达情况。方法：以从骨髓中分离培养的MSCs及软骨诱导培养后的细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNAs的表达情况,由SAM分析得到MSCs较其诱导培养细胞中差异表达的miRNAs,再进行生物信息学分析。结果：①分离培养出的MSCs经软骨诱导培养21天后,已具有软骨细胞特性,经芯片检测并SAM分析,软骨诱导培养的细胞较MSCs高表达的miRNAs有6个：hsa-miR-572、hsa-miR-130b、hsa-miR-193b、hsa-miR-28、hsa-miR-152、hsa-miR-560;软骨诱导培养的细胞较MSCs低表达的miRNAs有2个：hsa-miR-424、hsa-miR-122a。②利用TargetScan预测其靶基因,并行生物信息学分析,其中hsa-miR-130b、hsa-miR-193b、hsa-miR-152及hsa-miR-424的预测靶基因中多为参与细胞分化、骨形成、软骨形成及干细胞表型相关的基因。结论：hsa-miR-130b、hsa-miR-193b、hsa-miR-152和hsa-miR-424等对人骨髓来源间充质干细胞的软骨分化起着重要调控作用。     

骨形态发生蛋白诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前从骨髓中成功分离、鉴定BMSCs的方法较为成熟。新发现一些物质能诱导BMSCs向成骨细胞分化因子,其中对BMP研究较多。其机制可能是通过结合Ⅰ、Ⅱ型BMP受体后激活Smad信号通路诱导成骨。其诱导方法主要包括直接应用天然BMP或者将BMP及其协同基因转入BMSCs,通过靶细胞的持续表达BMP促进新骨形成。本文将近10年BMP诱导BMSCs向成骨分化的研究现状及发展趋势做一综述。     

黄精多糖对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中PINP和BMP-2表达的影响

探讨黄精多糖(PSP)对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用中I型前胶原N端前肽(Procollagen typeⅠN-terminal Propeptide,PINP)和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响。取8周龄雄性BALB/C小鼠1只,无菌操作分离小鼠股骨和胫骨,注射器冲出骨髓制成细胞悬液,传代3次后分为6组用于实验。空白诱导组仅加入等量成骨诱导培养基;阳性对照诱导组加入等量成骨诱导培养基及雌二醇(10-8mol/L);各PSP诱导组:加成骨诱导培养基和各自浓度的PSP(200、300、400、500 mg/mL)。每天在倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况及形态变化。倒置相差显微镜镜下观察细胞形态变化。在培养第7 d、第14 d采用ELISA酶联免疫吸附法分别测量细胞PINP和BMP-2的表达量。实验结果显示小鼠骨髓间充质干细胞原代培养呈长梭形,有接触抑制现象,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞生长密集时可重叠生长。各不同浓度PSP诱导组均比非诱导组高表达PINP和BMP-2(P0.01)。表明PSP呈剂量相关性促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,高浓度PSP可显著促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中BMP-2和PINP的表达。     

富血小板纤维蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）对体外培养的兔骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）成软骨分化的影响。方法：兔心脏采血制备PRF,电镜观察其超微结构;分离培养兔BMSCs,取第3代细胞用于实验．分为PIuF组、阳性对照组、空白对照组。诱导培养21d后,对三组细胞分别进行形态学观察,成软骨鉴定染色（甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色）,软骨相关基因表达检测（Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9）。结果：PRF组和阳性对照组中BMSCs经诱导后,细胞由长梭形变为三角形、多角形、圆形;甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9基因表达水平均较高,两组比较无统计学差异,空白对照组未见相关分化现象。结论：PRF在体外可促进兔BMSCs成软骨分化,可作为自体生物材料,在构建组织工程软骨中发挥更好的作用。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞

观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)植入体内后,在心肌微环境诱导下分化为心肌细胞的能力。无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,冲洗骨髓腔获得细胞,贴壁筛选法纯化MSCs,体外培养、扩增,4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记细胞,注入结扎冠脉左前降支所致心肌梗塞模型鼠的心肌组织。在不同时间点处死大鼠,获取心肌组织,采用HE染色和电镜技术对植入MSCs进行形态学观察和超微结构检测,荧光免疫组化检测植入MSCs肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性抗原Cx43的表达,同时应用RT-PCR技术检测心脏早期发育基因NKx2．5、GATA-4的表达。结果发现细胞标记效率为100％,通过连续检测MSCs植入后细胞形态从无规则状态、幼稚细胞表型逐渐向成熟心肌细胞方向转化,植入细胞排列同正常肌纤维方向平行,且植入四周后电镜检测到闰盘的存在;两周出现MHC的表达,后随时间延长表达逐渐增强。四周出现Cx43的表达,以后表达稳定,RT-PCR检测NKx2．5、GATA-4在一天即出现弱表达,两周～三周时表达最强,以后强度逐渐减弱。结果表明MSCs在体内微环境条件下能够转化为心肌细胞。     

富血小板纤维蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响*

摘要目的：观察自体富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）对体外培养的兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs）成软骨分化的影响。方法：兔心脏采血制备PRF,电镜观察其超微结构;分离培养兔BMSCs,取第3代细胞用于 实验,分为PRF组、阳性对照组、空白对照组。诱导培养21d 后,对三组细胞分别进行形态学观察,成软骨鉴定染色（甲苯胺蓝、II 型胶原免疫组化染色）,软骨相关基因表达检测（Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9）。结果：PRF 组和阳性对照组中BMSCs经诱导后,细 胞由长梭形变为三角形、多角形、圆形;甲苯胺蓝、II 型胶原免疫组化染色均为阳性;Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9基因表达水平均 较高,两组比较无统计学差异,空白对照组未见相关分化现象。结论：PRF在体外可促进兔BMSCs 成软骨分化,可作为自体生物 材料,在构建组织工程软骨中发挥更好的作用。     

丙二醛对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

为了探索氧化应激活性中间产物丙二醛对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制,体外培养的间充质干细胞经丙二醛处理后,在第4、7、14、21 d分别提取等份细胞进行碱性磷酸酶活性检测,第7 d时提取RNA通过实时定量RT-PCR测定ALP和Runx2/Cbfal mRNA表达,并在第21 d进行von Kossa染色,茜素红染色.研究发现:丙二醛通过降低碱性磷酸酶活性及ALP和Runx2/Cbfal mRNA的表达,抑制矿化骨节形成.这些结果表明:丙二醛可通过抑制ALP和Runx2/Cbfal通路,抑制小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化.     

Tie-2单克隆抗体鉴定人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的内皮细胞

目的:体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化,并探讨其可行性和条件.方法:利用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离MSCs,用含10?S的LG-DMEM培养基进行纯化和扩增培养,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度.用含VEGF(10μg/L)的HGDMEM培养基诱导MSCs向内皮细胞定向分化,Tie-2单克隆抗体的免疫组化法和透射电镜(TEM)鉴定其细胞的性质.结果:5.0×105个MSCs在体外扩增15代后,获得了8.0×1012个MSCs,扩增了约1.6×107倍.加入诱导培养体系培养14～21 d,光镜下可观察到内皮细胞呈典型的"鹅卵石"样:90%的细胞Tie-2免疫组化呈阳性反应;TEM下可观察到胞浆内有Weible-palade小体.结论:成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为内皮细胞的潜能,为构建心脏组织工程瓣种子细胞的来源提供了可能性.     

3种间充质干细胞成软骨分化潜能比较

目的:比较骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞的成软骨分化潜能,为软骨组织工程中种子细胞的选择提供实验依据。方法:采用贴壁法分别分离提取兔骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞,并进行传代培养,绘制3种间充质干细胞的生长曲线并比较其倍增时间。将3种间充质干细胞成软骨诱导14 d后,行甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色以观测3种细胞成软骨分化能力。结果:脂肪间充质干细胞的倍增时间短于骨髓间充质干细胞,滑膜间充质干细胞的倍增时间最短;3种细胞成软骨诱导14 d后均产生糖胺聚糖和II型胶原,且组与组之间II型胶原表达水平的差异有统计学意义,骨髓间充质干细胞组高于脂肪间充质干细胞组(P0.01),滑膜间充质干细胞组高于骨髓间充质干细胞组(P0.01)。结论:在一定的培养条件下,3种间充质干细胞均有一定的成软骨细胞分化潜能,滑膜间充质干细胞最快的增殖速度及最强的成软骨分化潜能。     

Notch信号参与BMP4诱导的间充质干细胞成骨分化及其机制的初步探讨

目的:探讨Notch信号对骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)诱导间充质干细胞成骨分化的影响以及作用机制。方法:(1)DAPT或Ad-dominant-negative mutants of Notch1(Addn Notch1)和BMP4-CM处理小鼠胚胎成纤维细胞,检测早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP);(2)茜素红S染色实验检测晚期成骨钙盐沉积情况;(3)半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨分化相关基因ALP,Runx2,Col1a1的表达;(4)免疫细胞化学检测p-Smad1/5/8的表达;(5)结晶紫染色和流式细胞术检测细胞的增殖及周期改变。结果:(1)DAPT抑制BMP4诱导的早期成骨分化,且呈浓度依赖性;(2)Delta-like 1(DLL1)促进BMP4诱导的成骨分化,DAPT和dn Notch1抑制BMP4诱导的成骨分化;(3)DLL1促进BMP4诱导的成骨相关基因ALP,Runx2,Col1a1的表达,DAPT抑制这些基因的表达;(4)DLL1促进BMP4诱导的细胞核内p-Smad1/5/8的表达,而DAPT抑制其表达;(5)DLL1促进BMP4诱导的细胞增殖,而DAPT抑制BMP4诱导的细胞增殖。结论:Notch信号通过BMP/Smads信号通路促进BMP4诱导的MSCs成骨分化,在此过程中也有促细胞增殖的作用。     

透明质酸在间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用

随着组织工程学的发展,利用间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向分化为软骨细胞,用于治疗骨性关节炎、关节创伤等因素造成的软骨缺损的研究方兴未艾。透明质酸(hyaluronic acid,HA) 是一种酸性多糖类生物大分子,亦是软骨基质的主要成分之一。由于其优良的生物相容性、可降解等特性,HA已成为优良的天然生物材料,其作为支架材料应用于软骨缺损修复已有一段历史。近年来又发现,HA除作为载体支架材料外,还可作为调节因子应用于MSCs向软骨细胞分化。以下将对近年来利用HA应用于MSCs向软骨细胞分化的研究进行总结,旨在为以MSCs为基础的组织工程化软骨的临床应用奠定基础。     

SFRP5抑制BMP9诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的:探讨脂肪因子分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein 5,SFRP5)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的影响。方法:将人脐带间充质干细胞根据不同的处理因素分为4组:对照组、BMP9组、BMP9+SFRP5组和SFRP5组;分别在3天、5天和7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性读数,7天进行ALP染色,21天进行茜素红染色检测钙盐沉积及油红O染色;收集不同组的细胞用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,获取的标本进行HE、Masson染色,Alcian blue染色及油红O染色检测。Western blot检测成骨分化相关蛋白Runx2和OPN的表达。结果:BMP9组的ALP活性读数和染色结果和茜素红染色结果均较对照组增加,而BMP9+SFRP5组则较BMP9组降低;BMP9处理后出现少量脂滴,而BMP9+SFRP5组脂滴明显增加,SFRP5组脂滴最多;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,对照组和SFRP5组没有形成肉眼可见的皮下包块,BMP9组和BMP9+SFRP5组能生成异位骨;4周后观测大体标本以及进行MicroCT检测,发现BMP9+SFRP5组的骨密度值小于BMP9组(P0.05)。HE、Masson染色,Alcian blue染色结果显示,BMP9组的骨分化程度大于BMP9+SFRP5,油红O染色结果示BMP9+SFRP5组有较多的成脂分化;SFRP5能抑制BMP9诱导的Runx2、OPN的蛋白质表达。结论:SFRP5抑制BMP9诱导的人脐带间充质干细胞成骨分化。     

骨髓来源的间充质干细胞分化能力的鉴定

本文研究了人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的成骨及成脂分化的潜能.通过加入诱导成骨的诱导剂,人的MSCs出现成骨分化的机箱,通过碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色及主要调控基因BMP2和Runx2的表达,确定了MSCs具有成骨分化的潜能.对于成脂分化,通过油红O染色,及主要标志基因PPARγ的表达确定其具有成脂分化的潜能.所以,从骨髓分离的到的MSCs纯度达到标准,并且具有成骨成脂分化的多向潜能,是一种理想的实验模型细胞.     

SATB2促进BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化

目的:研究特异AT序列结合蛋白2(Special AT-rich sequence-binding protein 2,SATB2)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)C2C12成骨分化中的作用。方法:首先用Ad-BMP9感染C2C12细胞,RT-PCR检测SATB2在基因水平上的表达变化,Western blot检测SATB2在蛋白水平上的变化;构建过表达SATB2重组腺病毒Ad-SATB2,感染C2C12细胞后,Western blot验证Ad-SATB2表达情况;用AdSATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞,碱性磷酸酶(ALP)活性和染色检测成骨早期ALP的变化,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积的变化。结果:Ad-BMP9处理C2C12细胞后,比对照组SATB2在基因水平和蛋白水平上表达量上调;Ad-SATB2可以在细胞中成功表达SATB2蛋白;用Ad-SATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞后,ALP以及钙盐的沉积与对照比较均上调。结论:SATB2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C2C12的成骨分化。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤

目的初步探讨骨髓间充质干细胞诱导为神经细胞,及其移植对大鼠脊髓半横断损伤神经功能恢复和运动的影响。方法贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),大鼠脊髓匀浆上清诱导第3代向神经细胞分化,经免疫组化鉴定分化后细胞的性质。制备大鼠半横断脊髓损伤模型,脊髓损伤局部注射BrdU标记诱导后的神经细胞。细胞移植5周后观察移植细胞在脊髓内存活分布情况。结果倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,有1~2个核仁,经脊髓匀浆上清诱导后,发出数个细长突起,并交织成网,诱导后的细胞表达Nestin,可推测诱导后的细胞为MSCs源神经细胞。5周后移植的MSCs在宿主损伤脊髓内聚集并存活,表达MAP-2、NF、GFAP与对照组比较有统计学意义(P0.05)。大鼠运动功能较移植前有所改善。结论MSCs经脊髓匀浆上清诱导后移植治疗大鼠半横断脊髓损伤可使运动功能得到改善。     

骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质再生过程中的初步研究

较大的腹壁缺损需要应用补片修复来缓解腹横筋膜的张力,人工合成补片的应用一定程度上实现了无张力修补的目的,但它在腹壁外科应用中有诸多的并发症,诸如复发率高,腹腔黏连,肠穿孔导致腹膜炎,侵袭性肠瘘等影响患者术后的正常生活,而脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix,ADM)作为一种新型的生物材料应用在腹壁外科中能解决上述人工合成补片所带来的并发症发挥强大作用且能与周围组织较好的融合,最后改建成宿主自身组织已并在多学科领域中广泛应用;骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能参与组织自我修复,并能分化成为多种功能细胞,分泌各种生长因子,在ADM内源性转归过程中可发挥作用。本文就对骨髓间充质干细胞在ADM生物补片应用于临床疝修补术中转归机制的研究做一综述。     

调控软骨形成的信号通路及相关因子在骨髓间充质干细胞骨向分化中的作用*

骨髓间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞,可以通过定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是目前骨再生医学和细胞治疗研究最多的理想种子细胞。在骨缺损的修复过程中,骨髓间充质干细胞内成软骨相关基因表达升高进而分化为软骨细胞,后期随着成骨细胞和破骨细胞的形成及血管长入,软骨基质逐步降解并被骨基质所替换。软骨细胞参与了骨缺损前期的修复过程,调控软骨形成的信号通路及相关因子不仅调控骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化,同时在成骨细胞分化过程中也发挥着重要的作用。对调控软骨形成的信号通路及相关因子在骨髓间充质干细胞骨向分化中的调控作用和研究现状进行了总结,以期为临床寻找更好的治疗骨缺损的方法提供理论依据和研究方向。