斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

[目的]研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异.[方法]用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长.[结果]cbh1基因全长为1500 bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602).克隆并分析了1.9 kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CRE Ⅰ与纤维素酶转录调控蛋白ACE Ⅰ的两个的潜在结合位点.[结论]在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2.两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的.     

匍枝根霉抑制性消减杂交差异文库的构建及分析

目的:研究匍枝根霉纤维素酶表达相关的调控基因。方法:使用抑制性消减杂交技术(SSH),成功构建了匍枝根霉纤维素酶系的表达差异cDNA文库。随机挑选200个阳性克隆子并进行测序,最终获得30个差异表达片段(ESTs)。结果:与GenBank比对后,获得了匍枝根霉纤维素酶表达过程中涉及的相关重要调控基因信息,包括纤维素酶系中的纤维二糖水解酶以及半纤维素酶系中的甘露糖苷酶等多种关键酶的信息。结论:为进一步研究与匍枝根霉纤维素酶表达相关的基因调控机制奠定了基础。     

人工锌指蛋白介导调控的里氏木霉纤维素酶生产

里氏木霉Trichoderma reesei Rut-C30是目前研究最广泛的纤维素酶生产菌,选育高产纤维素酶的里氏木霉菌株有助于提高木质纤维素资源生物炼制的经济性。利用人工锌指蛋白文库转化T.reeseiRut-C30,筛选获得了两株高产纤维素酶的突变株T. reesei M1和M2,与出发菌株比较,突变株M1和M2滤纸酶活分别提高100%和53%,且M1突变株外泌蛋白量提高69%,M2内切纤维素酶活提高64%。实时定量PCR分析结果表明,与对照菌株相比,突变株M1和M2中主要纤维素酶基因转录均上调,但不同酶基因在两株菌中有不同的变化特征。此外,纤维素酶抑制转录因子基因ace1在两株突变株中都转录下调,而纤维素酶正调控转录因子基因xyr1仅在M1突变株中上调。以上结果表明,不同人工锌指蛋白对纤维素酶活性的影响具有多样性。对这些突变体中人工锌指蛋白靶基因进行深入分析,为进一步深入探究里氏木霉纤维素酶合成调控的机理,以及利用代谢工程选育更高效的产酶菌株提供了基础。     

多靶向沉默里氏木霉碳代谢阻遏物对纤维素酶活性和表达的调控研究

【目的】构建多靶向siRNA表达载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1、CRE2、CRE3和CRE4进行同时多靶向siRNA干扰,以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。【方法】根据此前研究筛选出沉默cre1、cre2、cre3和cre4基因的4个最佳siRNA序列,设计并构建了A多靶向表达载体,另根据cre1、cre2、cre3和cre4基因中所含有的5个共有序列设计并构建了B多靶向表达载体,将两者转化至里氏木霉QM9414。经筛选后分别在48 h和120 h对各转化子进行纤维素酶酶活力测试(CMC活力测试和滤纸酶酶活力测试)及利用qPCR检测相关基因的表达。【结果】通过RT-qPCR测定结果表明,两种表达载体均可同时抑制里氏木霉的分解代谢物阻遏基因cre1、cre2、cre3和cre4的表达,纤维素酶活力比出发菌株明显升高,多靶向抑制菌株的CMC酶活和滤纸酶活比出发菌株平均提高了1.95倍和2.66倍。纤维素酶基因cbh1和egl1的表达水平比出发菌株也有明显提升,平均提高了3.83倍和3.95倍。纤维素酶相关基因xyr1的表达水平与出发菌株相比也明显上升,平均提高了2.78倍。【结论】多靶向沉默里氏木霉的碳代谢阻遏蛋白有利于解除葡萄糖效应,提高非还原糖的利用,从而提高纤维素酶的产量,使纤维素酶的表达得到更大的提升,为里氏木霉表达纤维素酶在分解代谢物阻遏基因调控方面提供了实验依据和新的技术思路。     

匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的初探及结构功能研究

纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶,前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶(CBS),可以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为糖基供体合成纤维二糖,从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径,通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA,分别转化原菌TP-02和△ugp突变株,构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用(LC-MS)检测突变株的胞内糖组分,发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱,但同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右,而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究,发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示,UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体,而GDPG可能是UDPG的替代物,在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外,利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析,经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300,为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。     

敲除组蛋白去乙酰化酶基因hdac对里氏木霉纤维素酶表达的调控作用

[背景]里氏木霉(Trichoderma reesei)是木霉属中产纤维素酶最具代表性的真菌之一,表观遗传调控是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,组蛋白去乙酰化是其中一种。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责脱乙酰化,敲除去乙酰化酶基因可引起菌株孢子、菌丝及纤维素酶活性等的一系列改变。[目的]通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase,hdac)建立了里氏木霉hdac缺失突变株(T.reesei△hdac),以研究对纤维素酶基因表达的调控作用。[方法]利用Split-Maker技术构建了组蛋白去乙酰化酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T.reesei QM9414。经PCR及Southern blotting验证正确后,对突变体T.reesei△hdac连续7 d检测滤纸酶活(filter paper activity,AFP)、羧甲基纤维素钠酶活(carboxymethyl cellulase activity,CMCA),利用RT-qPCR检测纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达。[结果]突变体T.reesei△hdac两种酶活力均显著高于出发菌株,分别高出8.00、30.00 IU/mL。突变体T.reesei△hdac纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平分别为出发菌株T.reesei QM9414的6.50、6.01和4.51倍。[结论]里氏木霉中纤维素酶的基因表达明显受到组蛋白去乙酰化酶基因(hdac)的调控,这为研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶的影响提供了新的证据。     

粗糙脉孢菌C2H2转录因子家族基因敲除突变体产纤维素酶筛选分析

丝状真菌的木质纤维素水解酶基因的表达很大程度上受到转录水平的调控,对纤维素酶系调控转录因子的研究对提高纤维素酶的产量具有重要意义。为了挖掘纤维素酶表达新调控基因,本研究对粗糙脉孢菌锌指转录因子C₂H₂家族的57株基因敲除突变株在以2%结晶纤维素为唯一碳源的培养条件下进行产纤维素酶水平分析筛选。通过测定发酵液的蛋白、内切β-1,4-葡聚糖酶酶活、外切纤维素酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活、木聚糖酶酶活及生物量,发现突变株L-38、L-85、L-40、L-64、L-99、L-07、L-86在蛋白水平及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活水平均比野生型有25%-77%不等的显著提高,而突变株L-87、L-06在蛋白水平及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活水平均比野生型有65%-80%不等的显著降低。这些纤维素酶新调控基因的获得为后续相关表达调控的研究提供了新素材。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

康氏木霉纤维素酶转录因子ACEII与外切纤维二糖水解酶基因 I（cbh1）启动子的结合分析

ACEI、ACEII和Xyr1是康氏木霉中调控纤维素酶基因表达的转录因子。体外实验已证实ACEI和Xyr1可与cbh1启动子上的287bp序列（-304bp~-18bp）结合从而调控cbh1基因转录,但ACEII是否可与此序列结合仍未清楚。为进一步研究ACEII调控纤维素酶基因表达的机制,利用PCR技术扩增康氏木霉ACEII DNA结合区的基因序列,并使其在大肠杆菌中表达。凝胶迁移率移动试验表明ACEII DNA结合区不能与cbh1启动子的287bp序列结合。提示了康氏木霉cbh1基因在诱导表达时起调控作用的主要是Xyr1,而不是ACEII。这对阐明真菌纤维素酶基因表达调控的分子机制具有重要的意义。     

东方肉座菌EU7-22纤维素酶基因的克隆及序列分析

东方肉座菌EU7-22与XC-9、里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉、斜卧青霉进行产纤维素酶比较,结果表明菌株EU7-22具有较高的产纤维素酶能力及完整的纤维素酶系.根据里氏木霉和绿色木霉的外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶相关基因序列,设计引物PCR扩增出菌株EU7-22 cbhⅠ、cbhⅡ、egⅠ、egⅡ及bgl Ⅰ.基因序列经NCBI Blast分析表明,cbhⅠ与绿色木霉cbh1基因(FJ871063)同源性最高达99％;cbhⅡ与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性最高达99％;eg Ⅰ与长枝木霉egl基因(GU144298)同源性最高达99％;egⅡ与绿色木霉eg2基因(EF602036)同源性最高达99％;bglⅠ与菌株Trichoderma sp.SSL bgl基因(FJ040193)同源性最高达100％.5种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高.对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白的分子量、等电点、N-糖基化位点、信号肽序列进行分析;对纤维素结合区及糖基水解酶家族特征结构区进行了定位;用SWISS-Model模拟了酶蛋白的三级结构.     

葡枝根霉TP-02cDNA文库中两种新的β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从具有良好降解纤维素能力的葡枝根霉TP-02的cDNA文库中筛选获得两个新的β-葡萄糖苷酶基因bgl1和bgl2,并在毕赤酵母中高效表达.阳性克隆在MM培养基中发酵84 h和1%的甲醇的诱导的情况下,产生的β-葡萄糖苷酶酶活达到峰值分别为8.2 IU/mL 和9.9 IU/mL,分别较原菌株葡枝根霉的β-葡萄糖苷酶酶活...     

葡枝根霉TP-02中的内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽胞杆菌WB600中的克隆和表达

利用cDNA文库筛选的方法将葡枝根霉TP-02中的内切葡聚糖苷酶基因(eg2和eg3)在枯草芽胞杆菌WB600中成功地克隆和表达。阳性克隆在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基中发酵36 h内切葡聚糖酶活达到最大值,分别为1.174和1.034 IU/mL,相比出发菌株发酵时间缩短了54 h。用G100分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得EGⅡ和EGⅢ分子量分别为44、46 ku。     

里氏木霉双基因同步缺失菌株的构建与甘露聚糖酶表达研究

在里氏木霉中建立了一个快速的双基因位点同步同源重组新方法,较好解决了里氏木霉基因逐个敲除周期长等问题。研究以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因（man5A）为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶Ⅰ（cbh1）基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因（cbh1、cbh2）,得到重组工程菌Man12。将重组工程菌Man12与出发菌株Tu6Δku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组菌株的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高10倍,而纤维素酶产量降低了60%,胞外总蛋白分泌水平降低了40%。Real-time PCR检测甘露聚糖酶基因（man5A）的转录水平,发现重组菌株较出发菌株提高了25倍。在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义。     

Novel cellulase profile of Trichoderma reesei strains constructed by cbh1 gene replacement with eg3 gene expression cassette

To construct strains of the filamentous fungus Trichoderma reesei with low cellobiohydrolases while high endoglucanase activity, the Pcbh1-eg3-Tcbh1 cassette was constructed and the coding sequence of the cellobiohydrolase I (CBHI) gene was replaced with the coding sequence of the eg3 gene by homologous recombination. Disruption of the cbhl gene was confirmed by PCR, Southern dot blot and Western hybridization analysis in two transforments denoted as L 13 and L29. The filter paper-hydrolyzing activity of strain L29 was 60% of the parent strain Rut C30, and the CMCase activity was increased by 33%. This relatively modest increase suggested that the eg3 cDNA under the control of the cbhl promoter was not efficiently transcribed as the wild type cbhl gene. However our results confirmed that homologous recombination could be used to construct strains of the filamentous fungus Trichoderma reesei with novel cellulase profile. Such strains are of interest from the basic science perspective and also have potential industrial applications.