湛江沿海潮间带产胞外纤溶活性酶类海洋真菌的生物多样性分析

【目的】研究湛江沿海硇洲岛和徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带产胞外纤溶酶样酶和纤溶酶原激活物海洋真菌的生物多样性,为发掘新型溶栓药物奠定基础。【方法】采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和酵母膏蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基分离培养海洋真菌,采用真菌r DNA转录间隔区1-5.8S r DNA-转录间隔区2(ITS1-5.8S-ITS2)片段的序列分析及其系统进化树构建的方法鉴定分离培养的海洋真菌,采用脱脂牛奶马铃薯葡萄糖琼脂(SM-PDA)培养基培养法筛选产胞外蛋白酶的海洋真菌,采用海水纤维蛋白马铃薯葡萄糖琼脂(FN-PDA)培养基培养法筛选产胞外纤溶酶样酶和/或纤溶酶原激活物的海洋真菌。【结果】从湛江沿海的硇洲岛和徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带分离、培养和鉴定了海洋真菌446株,含真菌的98个种,分布于真菌域子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的6个纲、18个目、46个科、65个属;其中产胞外蛋白酶的海洋真菌有265株,61个种,分布于41个属;产胞外纤溶酶样酶的海洋真菌有67株,22个种,分布于14个属;产胞外纤溶酶原激活物的海洋真菌有84株,23种,分布于13个属;优势属为曲霉属(Aspergillus),其次为青霉属(Penicillium)。【结论】湛江沿海潮间带可分离培养的产胞外纤溶酶样酶和纤溶酶原激活物的海洋真菌物种丰富多样,是发掘新型溶栓药的丰富资源。     

徐闻珊瑚礁自然保护区可培养富脂海洋微藻的生物多样性

从徐闻珊瑚礁自然保护区(20°10′–20°27′N, 109°50′–109°24′E)潮间带采集海水和泥沙样品, 用f/2-medium 培养液富集培养其中的海洋微藻, 采用基于96 孔板的“稀释分配”结合“微吸管剔除”的方法分离培养海洋微藻, 采用微藻形态学观察、18S rDNA 序列分析及其系统进化树构建的方法分析鉴定分离培养的藻株, 采用尼罗红染色法检测和分析海洋微藻细胞中的脂质。目的就是要分析研究徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带可培养富脂海洋微藻的生物多样性, 为富脂海洋微藻的研究开发奠定基础。结果分离、培养、鉴定并储藏了118 株海洋微藻(Genbank 登录号为KU561102 ~ KU561219),含48 个种, 分布于硅藻门(Bacillariophyta)、绿藻门(Chlorophyta)和定鞭金藻门(Haptophyta) 3 个门的6 纲、22 目、24 个科、28 个属。其中, 有37 株为富脂微藻, 含22 个种, 分布于硅藻门和绿藻门2 个门的4 纲、11 目、12 个科、16 个属; 优势属为双眉藻属(Amphora), 含22 株,占分离培养藻株的18.6%; 含脂量最高的种群为辐节藻属(Stauroneis), 含Stauroneis anceps, Stauroneis gracilior, 和2 株Stauroneis kriegeri, 共4 株海洋微藻。这表明徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带可培养的富脂海洋微藻的物种丰富多样, 可能是发掘多不饱和脂肪酸和生物柴油的理想资源。     

基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景

基因芯片通常指DNA芯片,其基本原理是将大量的寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号从而获取结果。多年来,我国在医药疾病研究、微生物检测等领域已成功研制出多种基因芯片,取得了骄人的成绩,但在对海洋微藻研究的应用上成果较少。现着力从实际应用的角度阐述基因芯片及其在海洋微藻研究中的应用。     

邻苯二甲酸二甲酯(DMP)对海洋微藻的生态毒理研究

通过96h的急性毒性实验,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)对杜氏盐藻(Dunaliella salina)、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)三种海洋微藻的致毒效应,探讨了三种海洋微藻对DMP的耐受性及两者之间的相互作用。结果显示DMP对三种微藻的生长均有抑制作用,在DMP的处理浓度分别为0.1、10、40、80和200mg·L^-1时,与对照组相比,DMP生长抑制百分率分别为22.9～93.1%、42.1～82.2%和61.9～92.2%。DMP对对杜氏盐藻、绿色巴夫藻和三角褐指藻的EC₅₀值分别为103.3、43.9和0.12mg·L^-1。     

分离自象山港的15种海洋微藻脂肪酸比较研究

在160μmol.m-2.s-1光强、（20±2）℃条件下对分离自象山港的15种海洋微藻进行培养,在稳定期离心收集,冷冻干燥后用Bligh-Dyer法提取总脂,皂化衍生化后用气相色谱-质谱联用分析系统对其含有的脂肪酸进行定量和定性的分析。结果表明,这15种微藻总脂含量均较高,其中有9种微藻的总脂含量超过干重的10%,中心硅藻纲中共有的含量相对较高的主要脂肪酸为C14∶0、C16∶0、C16∶1（n-7）脂肪酸和EPA,针胞藻纲的赤潮异湾藻则含有高比例的C16∶0、C18∶4（n-3）和EPA,纵裂甲藻纲和甲藻纲中共有的含量相对较高的主要脂肪酸为C16∶0、C18∶4（n-3）、C18∶5（n-3）和DHA,而隶属于定鞭藻门颗石藻纲的颗石藻含量相对较高的主要脂肪酸分别为C16∶0、C18∶4（n-3）和DHA。这些藻是否可以作为生物饵料还需实际养殖投喂效果决定。     

10种海洋微藻总脂、中性脂和极性脂的脂肪酸组成

研究了10种海洋微藻的总脂、中性脂和极性脂的脂肪酸组成特征。海洋微藻的脂肪含量均在15％以上。极性脂一般为海洋微藻的主要脂类,是长链多元不饱和脂肪酸的主要提供者。中性脂含短链脂肪酸较多,为主要的储存脂类。绿藻纲可以将高含量的16:4(n-3)和18:3(n-3)作为化学分类的标记脂肪酸,小球藻和微绿球藻有丰富的20:5(n-3),与绿藻纲显著不同,可能属于大眼藻纲。绿枝藻纲的脂肪酸组成与绿藻纲类似,绿胞藻纲以16:0、18:4(n-3)和20:5(n-3)为主要脂肪酸。脂肪酸组成可用于海洋微藻的分类学研究,并能指导利用海洋微藻生产高度不饱和脂肪酸。     

5株新分离海洋硅藻总脂和脂肪酸组成的比较研究

从浙江渔山列岛、朱家尖海域拖网采集浮游植物,采用平板分离法和水滴分离法分离、纯化出5株硅藻,用MAV培养基进行培养,采用Bligh—Dyer法和气相色谱-质谱法,对5株海洋硅藻的总脂及脂肪酸组成进行了分析比较。结果表明：在水温17—25℃,盐度25,自然光照,不充气培养条件下,5株海洋硅藻的总脂含量为15．14％-28．07％,除成对海链藻（Thalassiosirabinata）外,大龙骨藻（Tropidoneismaxima）、咖啡双眉藻（Amphoracoffeaeformis）、曼氏骨奈藻SM-2012—1（Skeletonemamunzelii）、曼氏骨条藻SM-2012-2（Skeletonemamunzelii）的总脂含量均超过其干重的20％。除咖啡双眉藻的20：4n_6含量高于20：5n4外,其它4株硅藻的20：5n．3在脂肪酸组成中含量较高,达22．04％-27．74％;5株硅藻中C18系列脂肪酸含量较低,为0．13％-7．6％;咖啡双眉藻除外的其它4株硅藻均舍有一定量的22：6n-3（2．40％-3．45％）。最终选出大龙骨藻（Tropidoneis maxima）、曼氏骨条藻SM-2012-1（Skeletonemamunzelii）、曼氏骨条藻SM-2012-2（Skeletonemamunzelii）具有开发的潜能。     

三种环境激素对四种海洋微藻的急性毒性效应研究

近年来,海洋环境激素污染日益严重,为了考察环境激素对海洋微藻的生物毒性效应,进而评估其对海洋生态系统的影响,该实验研究了三氯卡班、邻苯二甲酸二丁酯、三丁基氯化锡三种环境激素对海洋小球藻(Chlorella sp.)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis ocutala)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense )4种海洋微藻的急性毒性效应。结果表明,三种环境激素均可显著抑制该4种微藻的生长。三氯卡班对4种微藻的96 h-EC₅₀分别为108.19 μg·L^-1、63.21 μg·L^-1、60.73 μg·L^-1和57.58 μg·L^-1;邻苯二甲酸二丁酯对4种微藻的96 h-EC₅₀分别为1.42 mg·L^-1、1.02 mg·L^-1、1.47 mg·L^-1 和1.21 mg·L^-1;三丁基氯化锡对4种微藻的96 h-EC₅₀分别为3.5 μg·L^-1、4.36 μg·L^-1、0.6 μg·L^-1和0.6 μg·L^-1。三种环境激素对四种海洋微藻的毒性强弱顺序为三丁基氯化锡>三氯卡班>邻苯二甲酸二丁酯。     

富硒灵芝菌丝多糖、蛋白的提取及其体外抗氧化和抗肿瘤活性研究

灵芝具有较强的硒富集能力,其中的硒元素多以硒多糖、硒蛋白等有机硒形式存在。本研究以灵芝菌丝为研究对象,采用不同方法提取菌丝多糖及菌丝蛋白,探究外源施硒对二者的含量及其抗氧化活性的影响,并初步探究了水提多糖和可溶性蛋白的抗肿瘤活性。结果表明,以硒含量为95μg/mL的培养基发酵得到的菌丝体,其可溶性蛋白及硒含量较高,分别为1.630 8 mg/g和36.905 7μg/g;采用超声辅助碱提法时,多糖含量较高,为32.070 9 mg/g,且该多糖的硒含量为33.864μg/g。与对照组相比,富硒组灵芝菌丝体其多糖和蛋白的抗氧化性较强,且均表现出浓度依赖性。此外,富硒灵芝菌丝体其硒多糖对肿瘤细胞的抑制增殖效果较好,对HCCLM、A549和HSC-3肿瘤细胞的IC₅₀值分别为3.765、3.23和2.267 mg/mL;但其硒蛋白对上述三种癌细胞的增殖抑制效果较差,其IC₅₀值分别为636.987、506.97、555.598μg/mL。     

3种海洋赤潮微藻蛋白质和核酸合成对UV-B辐射增强的响应

应用同位素标志法, 研究了赤潮异弯藻 (Heterosigmaakashiwo) 、亚历山大藻 (Alexandriumtamarense ) 和中肋骨条藻 (Skeletonemacostatum) 核酸和蛋白质合成对紫外线B波段 (UV_B, 2 80~ 32 0nm) 辐射增强的响应变化。结果表明 :1) 按照由高到低的顺序, 3种海洋赤潮微藻对UV_B辐射增强的敏感性依次是赤潮异弯藻、亚历山大藻和中肋骨条藻。 2 ) UV_B辐射增强抑制赤潮异弯藻的生长和脱氧核糖核酸 (DNA) 的合成, 而低剂量的UV_B辐射对中肋骨条藻和亚历山大藻的生长与DNA的合成表现出刺激作用, 高剂量则表现出抑制作用。 3) 随着UV_B辐射的增强, 3种海洋赤潮微藻核糖核酸 (RNA) 和蛋白质的合成速度下降, 其中赤潮异弯藻合成速度的下降幅度明显大于中肋骨条藻和亚历山大藻, 表明赤潮异弯藻RNA和蛋白质的合成对UV_B辐射增强的敏感性高于中肋骨条藻和亚历山大藻。