日本鳗鲡对蛋白质消化率的初步研究

日本鳗鲡是西太平洋地区重要的养殖品种。不少国家和地区相当重视对它的营养和消化生理的研究,其对饲料蛋白质的消化率测定也有报道。然而迄今为止还缺乏体长、水温对消化率影响的研究资料。在国内,这方面的研究则是一     

海刺参i型溶菌酶基因的重组表达及抑菌谱分析

将本实验室已分离到的海刺参 (Stichopus japonicus) i型溶菌酶的基因(GenBank Accession No. EF036468)亚克隆进原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组质粒pET32a(+)-SjLys, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。阳性克隆子经诱导表达、亲和纯化和透析复性, 得到了酶活力为19.2 U/mg的重组SjLys (rSjLys), 并对rSjLys进行了抑菌谱测定。结果表明, rSjLys对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用, 尤其对常见的海洋致病菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有很强的抑菌活性。更为显著的结果是, rSjLys经100oC、40 min加热处理后, 失活的rSjLys对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌能力高于rSjLys的9%~25%。上述结果表明, 海刺参溶菌酶是一种具有糖苷酶活性和非酶抑菌活性的特殊的i型溶菌酶, 且具有很广的抑菌活性, 在海刺参机体先天免疫系统中是一个重要的效应分子。     

重组海参溶菌酶工程菌发酵及表达产物纯化和性质的研究

旨在研究重组海参i型溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)可溶性表达的发酵条件、纯化及生物学性质.采用摇瓶发酵的培养方式,分别从培养基组分和发酵条件两个方面对获得可溶性重组SjLys进行研究.表达产物通过亲和层析纯化以及凝胶过滤层析脱盐,获得了电泳纯为95%的重组SjLys蛋白.进一步对其生物学活性分析,结果表明该酶最适温度为45℃,最适pH值为6.8,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广谱抑菌作用.上述结果将为海参溶菌酶进行产业化奠定应用基础.     

七鳃鳗g型溶菌酶的分子特征和抗菌活性

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白．本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因. 其酶基因cDNA为701 bp（GenBank 序列号KP204854）,开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 kD,等电点为5.48,含有1个半胱氨酸残基,无信号肽．实时荧光定量PCR分析表明,七鳃鳗g型溶菌酶基因在各组织中广泛表达,其中在肠中表达量最高．脂多糖（LPS）体内刺激七鳃鳗后发现,溶菌酶在口腔腺和头肾表达量显著升高．以溶壁微球菌和哈维弧菌为底物检测重组g型溶菌酶的活性时,均表现出抗菌活性,最适pH为7.5,最适温度为35℃．扫描电镜分析表明,重组酶能够使溶壁微球菌破裂．以上结果均表明,g型溶菌酶在七鳃鳗的先天免疫系统防御病菌感染中起到重要作用．     

日本鳗鲡IFN-γ基因的鉴定、表达模式及启动子活性分析

为揭示鱼类IFN-γ的生物学功能, 研究从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得了IFN-γ基因, 命名为AjIFN-γ。AjIFN-γ具有脊椎动物IFN-γ的典型特征: 包括4外显子/3内含子的基因结构、C端的IFN-γ特征性氨基酸基序和1个核定位信号, 以及6个α-螺旋反向平行构成的二级结构。AjIFN-γ在日本鳗鲡所有组织中均低水平转录表达, 其中肝脏中表达量最高, 其次是皮肤和头肾。Poly I:C刺激和迟缓爱德华氏菌感染均可显著诱导AjIFN-γ在鳃、头肾、体肾和(或)脾脏中的转录表达, 表明AjIFN-γ能够参与日本鳗鲡抗菌和抗病毒的免疫过程。此外, 研究还克隆了AjIFN-γ基因的5′调控区序列共1536 bp, 并构建了一系列Aj IFN-γ 5′调控区删节突变体, 分析其启动子活性, 结果表明, 上游–240/+136区域中含有起始AjIFN-γ转录的关键启动子调控元件, –1062/–814区域存在转录的正调控元件, 而–1252/–1062区域存在转录的负调控元件。上述结果进一步丰富了鱼类IFN-γ的基础知识。     

异育银鲫c型溶菌酶全长cDNA序列的生物信息学分析及其组织表达分析

利用RACE及克隆等方法获得了异育银鲫（Carassius auratus gibelio）c型溶菌酶基因全长cDNA序列．序列分析表明,所克隆的异育银鲫溶菌酶的cDNA全长751 bp,包括溶菌酶基因开放阅读框（ORF）438 bp,5′ 非编码区（UTR）为109 bp和3′ UTR为204 bp．438 bp ORF共编码146个氨基酸,其成熟肽的分子量预测值为14　543.6,理论等电点为8.86．通过ClustalW软件,将异育银鲫和其它多个物种c型溶菌酶的氨基酸序列进行多序列比对发现,所克隆的异育银鲫溶菌酶编码的氨基酸序列中存在c型溶菌酶的活性中心（Glu53和Asp69）,且与活性位点相邻的氨基酸序列高度保守．同时,8个保守的半胱氨酸残基也与其它物种的c型溶菌酶相一致．结合BLASTN分析的结果,可以确认所获得的异育银鲫溶菌酶cDNA序列属于c型溶菌酶．异育银鲫c型溶菌酶和人c型溶菌酶（pdb 1at6_）在蛋白质序列上有50%相似性,其三维（3-D）结构非常类似．通过氨基酸空间位置比较发现,两者具有类似的酶活中心,异育银鲫c型溶菌酶只能形成3个二硫键,比人少1个．荧光定量RT-PCR检测和溶菌酶活性测定显示,异育银鲫头肾和脾脏c型溶菌酶mRNA的表达量约为肝胰脏的2.9 倍和1.7 倍,异育银鲫头肾和脾脏的溶菌酶活性约为肝胰脏的6.2 倍和4倍．     

动物源溶菌酶研究进展

动物源溶菌酶是一种动物体内广泛存在的酶类,它可以水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用.目前溶菌酶已被用作研究蛋白功能、性质以及分子进化的模型.首先介绍了溶菌酶及其分子的晶体结构,溶菌酶基因及其蛋白研究进展,其次介绍了动物源溶菌酶的功能,包括溶菌酶生物学功能和重组蛋白功能活性,重点介绍了溶菌酶基因在转基因工程中的应用研究,最后对动物源溶菌酶研究进行了展望.研究动物源溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力具有重要的指导意义.     

日本对虾c型溶菌酶的高效重组表达及产物分析

从日本对虾(Marsupenaeus japonicus)血液中提取总RNA,根据GenBank已登录的该cDNA序列(AB080238),通过RT-PCR技术扩增出日本对虾溶菌酶(MjLys)成熟肽基因。该基因完整的开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸(aa),前18 aa为信号肽,成熟肽由140 aa组成,分子量为16.4 kD,理论等电点(pI)为8.80。经分析表明,该基因含有一个完整的c型溶菌酶结构域(1-130 aa),包括c型溶菌酶特有的两个活性中心Glu33和Asp50,以及8个保守结构Cys残基。将MjLys成熟肽基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS中诱导发酵,实现了重组MjLys蛋白的高效表达,并测定了该重组蛋白对几种细菌的抑菌活性。结果表明,重组日本对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均有显著的溶菌活性。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。       

睾酮对日本鳗鲡离体下丘脑-脑垂体复合物GtH合成与分泌的影响

用离体孵育的方法研究了睾酮（T）对日本鳗鲡（Anguilla japonica)完整的正丘脑-脑垂体复合物（hypothalamus-pituiary complex,HPC)、分离的下丘脑（hypothalamus,H)加脑垂体（pituitary,P)以及单独的脑垂体（pituitary,P)促性腺激素（GtH)合成与释放的影响,在不加T的孵育液中孵育,HPC组的孵育液及其脑垂体中的GtH含量最高,H P组次之,而P组最低,表明下丘脑通过GnRH直接刺激脑垂体GtH的合成与释放,在加入T的孵育液中孵育,P组的孵育液及脑垂体中的GtH含量显著增加,并且和孵育液中的T呈剂量依存的正反馈作用,当T和H与P一起孵育时,低浓度的T（0.1和1μmol/L)刺激HPC组和H P组的GtH释放,呈现正反馈作用,而高浓度的T（10μmol/L)则抑制HPC组和H P组的GtH释放,表现负反馈作用。这些结果直接证明日本鳗鲡下丘脑对脑垂体GtH分泌的调控以及性类固醇激素（如雄鳗的睾酮）对脑垂体GtH分泌的反馈作用。     

日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21（Toll like receptor 21）在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21（AjTLR21）cDNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。AjTLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,AjTLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,AjTLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,AjTLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调（P < 0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示,在AjTLR21 5'上游调控序列-1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,AjTLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明AjTLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡AjTLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。     

日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

为探讨鱼类抗菌肽基因的生物学功能,研究应用RACE方法克隆获得了日本鳗鲡 (Anguilla japonica) 肝脏表达抗菌肽2基因 (Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2,LEAP-2),即AJLEAP-2的cDNA序列,全长为450 bp,开放阅读框编码89个氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序C-X5-C-X4-C-X4-C。AJLEAP-2基因组结构与其他脊椎动物LEAP-2相同,都包含有三个外显子。利用荧光定量PCR检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织/器官中的表达,发现其转录子在肝脏中表达量最高,是内参基因 (-actin) 的6倍; 其次是肠道,但其表达量仅为肝脏的1/130。此外,还检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡玻璃鳗(Glass eel)阶段的转录表达水平,结果显示,玻璃鳗中AJLEAP-2的转录表达量仅低于黑仔期的肝脏,为黑仔鳗肠道表达量的2倍。LPS和迟缓爱德华菌 (Edwardsiella tarda) 刺激能显著上调鳗鲡血液中AJLEAP-2的转录表达,刺激16h后上调倍数最高,分别为对照组的86倍和12倍。此外,LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后,肠道中AJLEAP-2显著上调表达(P0.05),为对照组的8倍。Poly I:C刺激24h后,血液中AJLEAP-2转录表达显著下调。结果表明,AJLEAP-2在日本鳗鲡抗细菌感染过程中起重要的作用。     

日本鳗鲡精子形成过程中的形态结构特点

本文通过扫描电镜、透射电镜观察了日本鳗鲡（Anguilla japonica）精子形成的特殊过程及产生细胞器的特殊结构。由精细胞变成精子包括四个特殊阶段,即经过早期、中期、晚期和精子期．最后形成正常成熟的精子．（1）早期阶段：其特征是细胞核由椭圆形逐步变成长条形;在细胞核的一端．有一个大的圆的染色较浅的形状似球形的特殊结构,约占细胞核的三分之一,其内含有少量着色深的颗粒状和线条状物质,外面由质膜包被着与细胞核分开,该结构和细胞核的外层还有一层质膜包着形成一个整体：精子早期阶段没有形成独立的线粒体和中心粒。（2）中期阶段：其特征是细胞核呈长条形．有球形结构的一端成为细胞核的上端,无球形结构的一端成为细胞核的下端,在下端出现鞭毛的原基;球形结构伴随着精子的发生也发生变化,内部逐步分化出中心粒和线粒体等细胞器：在细胞核的中段有明显的溶酶体分布。（3）晚期阶段：其特征是细胞核呈“眉形”或“新月形”．中心粒从球形结构中释放出来形成独立结构．球形结构中只剩下还没有形成独立结构的线粒体：在细胞核的下端鞭毛的原基处长出较长的鞭毛,这时期的精子已具有运动能力。（4）精子期：其特征是细胞核呈圆形,中心粒位于植入窝内,线粒体分布在细胞核的下面．在线粒体的下面有袖套腔形成,此时形成的鞭毛为“9＋2”结构。日本鳗鲡精子经过四个时期的变态．才能形成真正成熟的精子。     

欧洲鳗鲡红头病病原的研究

我国南方各省欧洲鳗鲡养殖过程中,在黑仔及幼鳗期易发生一种以头部充血发红为主要特征的严重疾病,被称为“红头病”。本文描述了欧鳗红头病的症状,从病鳗血液中分离到３株菌,肌注和口服人工感染试验出现与自然发病相似的症状,死亡率分别９ ８３％和６７％,从病鳗身上重新分离到性状的菌株。４株分离菌的特性完全一致。均为革兰氏阴性杆菌,以周鞭毛运动,兼性压氧,发酵葡萄糖产酸,氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,还原硝酸盐Ｖ     

欧洲鳗鲡外周血细胞的显微和超微结构

利用光镜和透射电镜技术研究了欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）外周血细胞的显微和亚显微结构。结果表明：在外周血细胞中可以区分出红细胞、单核细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血栓细胞;嗜中性粒细胞内的特殊颗粒包括A、B、C三型;嗜中性粒细胞分为Ⅰ型粒细胞（内含A、B、C三种特殊颗粒）、Ⅱ型粒细胞（内含A型和C型两种特殊颗粒）和Ⅲ型粒细胞（内含C型特殊颗粒）。还见到幼稚的和正在分裂的红细胞和单核细胞,提示示幼稚的红细胞能直接进入外周血流中,嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞无论在血涂片上或超薄切片上均未见到。描述了上述各种血细胞在光镜和电镜观察下的形态和细微结构。血栓细胞体积最小,嗜中性粒细胞体积最大;淋巴细胞数目最多,嗜中性粒细胞数目最少。     

鳗鲡肝脏、脾脏显微与超微结构

经光镜和电镜观察发现：鳗鲡肝脏的肝小叶不规则。肝细胞胞质内富含多种细胞器及包含物。胆小管由２—４个肝细胞围成，相邻肝细胞间有连接复合体封闭胆小管。肝血窦为有孔型、孔处无隔膜，内有巨噬细胞。窦周隙明显，未见贮脂细胞。肝细胞向胆小管腔与窦周隙面伸出许多指状微绒毛。脾脏内白髓中淋巴细胞聚集成群，未见明显脾小结、淋巴鞘。红髓由脾索与脾窦组成，动脉分支末端（壁厚的毛细血管）可开放于红髓，无明显巨噬细胞中心。脾窦及脾小动脉内皮细胞通常为长杆状、沿血管纵向平行排列。脾窦为有孔型，孔处可见薄的隔膜。脾小动脉内皮外为２—５层平滑肌（多数为纵行）。     

鳗鲡幼鱼耳石日轮的研究

本文报道采自辽东半岛沿岸鳗鲡(Anguilla japonica)的白仔鳗和经人工培育的当年幼鳗耳石日轮生长的观察结果。白仔鳗和幼鳗耳石平均直径均与体全长成直线相关。12尾白仔鳗耳石的平均日轮数146.3,据此推测其产卵期为11—12月。观察证实从咸淡水转人到淡水生活的幼鳗耳石的环纹有过渡带存在。     

长江靖江段沿岸日本鳗鲡丰度的时间格局及生物学研究

于2002-2017年在长江靖江段沿岸对日本鳗鲡资源量进行长期调查,对其丰度的时间格局特征及环境影响因素等进行了分析.结果 显示,在近16年519次调查中,采集到日本鳗鲡137尾,平均年龄(1.8±1.0)龄,平均全长和体质量分别为(31.1±9.8) cm和(57.64±91.94)g,89.1％的个体未性成熟,94...