池蝶蚌STAT基因的克隆及功能分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)信号转导及转录激活因子STAT基因的初步功能, 通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得STAT的cDNA全长序列(GenBank ID: KY123702), 命名为HsSTAT, HsSTAT全长为2752 bp, 5′-非编码区(5′UTR)为121bp, 3′-非编码区3′UTR为264 bp, 开放阅读框(ORF)为2367 bp, 编码788个氨基酸; 生物信息学分析发现该蛋白结构域主要由STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind、SH2四个经典保守性功能域组成; 缬氨酸最多占12.9%。色氨酸使用频率为100%。二级结构中α螺旋最多占46.83%、β折叠最少占8.5%。HsSTAT蛋白亲水性指数为– 0.531, 是亲水性蛋白。预测到棕榈酰化修饰位点1个, 小泛素相关修饰序列3个, 磷酸化修饰位点22个。系统进化树分析显示, HsSTAT与光滑双脐螺STAT5B和盘鲍STAT5聚在一支; 亚细胞定位结果显示HsSTAT定位于血细胞的细胞质中; 荧光原位杂交结果显示HsSTAT主要在细胞核。qPCR结果显示HsSTAT在所有的组织中均有表达, 其在组织中的表达量在肝胰腺中最高, 在血细胞中最低。细胞增殖实验显实验组增殖率为119%, 高于对照组。实验已克隆到HsSTAT的全长序列, HsSTAT可能为STAT5亚型, 具有促进SMCC-7721细胞增殖的功能, 推测具有池蝶蚌细胞的信号转导功能参与池蝶蚌的先天免疫。     

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低; HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。     

三角帆蚌SOX2基因的分子鉴定及表达分析

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见。本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个。该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高。实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程。     

池蝶蚌组织蛋白酶L基因的组织表达及免疫应激分析

应用cDNA文库筛查及同源片段克隆拼接技术,克隆了池蝶蚌组织蛋白酶L(Hs-CtsL)cDNA基因全长序列(GenBank注册号为JN604558)。其cDNA全长1152 bp,5′-非翻译区(Untranslated Region,UTR)长1 bp,3′-UTR长149 bp包括1个多聚腺苷信号AATAAA和Poly(A)尾巴,开放阅读框(Open reading frame ORF)为1002 bp,编码333个氨基酸组成的多肽链。其分子量约37.7 kD,理论等电点为7.16,包含信号肽、前体域和成熟域。系统进化分析显示,Hs-CtsL同无脊椎动物组织蛋白酶L聚为一支,且同三角帆蚌亲缘关系最近,其次为褶纹冠蚌。组织表达分析结果显示,池蝶蚌组织蛋白酶L在肠、鳃、性腺、外套膜、斧足、闭壳肌、血细胞、肝胰腺、肾和心脏均有表达,其中血细胞中表达量最高。应激实验表明,经嗜水气单胞菌刺激后,Hs-CtsL在血细胞、鳃、肝胰腺和外套膜中的表达量显著上调。其中在肝胰腺中刺激后6h表达量到达峰值,在血细胞、鳃和外套膜中的表达模式近似,表现为一个波动变化,在4h、12h和48h被上调。结果暗示着Hs-CtsL除参与了池蝶蚌血细胞的先天性免疫防御以外,还参与了其消化腺免疫器官的免疫应答反应。     

池蝶蚌致雄性化基因fem-1c及其蛋白分子的结构特征分析

研究首次获得淡水珍珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)的致雄性化基因feminization-1C亚型,即fem-1c基因,并进行全长克隆及序列分析。从转录组中Race-PCR扩增fem-1c基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对fem-1c基因进行基因组结构分析、多序列同源性比较、跨膜区段、亲疏水性分析、功能结构域预测等。研究结果如下:该cDNA序列全长2328 bp,包含一个1869 bp的最大开放阅读框,编码622个氨基酸,经同源比对和进化树分析,fem-1基因c亚型编码的氨基酸与太平洋牡蛎的同源性最高,为79%;疏水性分析显示该蛋白为亲水性蛋白;二级结构预测发现该蛋白有大量的α螺旋和随机卷曲,形成9个锚蛋白重复序列(Ankyrin repeat,ANK),同时,三级结构预测中可以清楚的看到9个ANK模体,跟SMART预测的结构位点结果相近。从无脊椎动物到脊椎动物fem-1c基因的保守性表明它们有共同的起源,暗示这个基因家族在功能上具备保守性,推测池蝶蚌fem-1c基因可能具备与线虫fem-1基因在性别决定方面上相似的功能。     

棉铃虫β-catenin基因的克隆、表达分析及真核表达载体构建

β-catenin基因是生物进化上高度保守的基因,是Wnt/β-catenin信号通路中的重要组分。本研究通过RACE方法获得了棉铃虫β-catenin基因的全长c DNA序列,命名为Har-β-catenin(Gen Bank登录号为KJ206237)。其开放阅读框长2382 bp,编码793个氨基酸残基。与已报道的其它物种β-catenin蛋白相似,Har-β-catenin蛋白具有多个ARM重复结构域。运用RT-PCR的方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达情况,结果表明非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达水平高于滞育蛹脑。最后,我们构建了包含Har-β-catenin全长编码区的真核表达载体并调查了Har-β-catenin的亚细胞定位情况。这些结论为我们进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫滞育中的作用奠定了基础。     

嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA 文库的构建和亲环蛋白基因序列的初步分析

实验利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)14h,将诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA 进行逆转录, 用LD-PCR 法合成双链cDNA, 从而首次成功构建池蝶蚌血细胞的全长cDNA 文库。原始文库的滴度为4106 cfu/cm3, 重组率为90%, 扩增后文库的滴度为3.55109pfu/mL。目前文库已随机测序672 个样品, 将所得双向序列进行拼接, 去除载体, 并多序列比对去除重复序列后, 发现436 条为已知功能序列, 其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp, 最大长度为2153 bp, 平均大小608.6 bp, 表明插入片段大小理想。从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析。结果显示, HsCyp A 全长1229 bp, 序列包括52 bp 的5非编码区、495 bp 的开放阅读框、682 bp 的3非编码区和29 bp 的poly(A)尾, 没有明显的加尾信号。对Cyp A 氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模, 同时构建了其系统进化树, 分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。综合分析, Cyp A 在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白, 而是可能在病原感染防御中发挥重要作用。       

温度对池蝶蚌雌雄同体和性逆转的影响

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响, 研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察, 并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化。通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测, 同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位。结果显示: 在自然条件下, 6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象, 28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8%分化为雄蚌, 16.7%维持雌雄同体现象, 5.5%分化为雌蚌)。在不同温度刺激下, 14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象。32℃刺激, 14月龄雄蚌出现12.5%雌雄同体; 27℃刺激, 14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5%和12.5%性逆转; 23℃刺激, 14月龄雌蚌出现14.29%性逆转; 19℃刺激, 14月龄雌蚌出现25%性逆转。qRT-PCR结果显示: Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期, 32℃刺激, 在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度, 19℃刺激, 在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度; Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致, 与Tra2a大体一致, 在5、32月龄与Sox9相互抑制; 19℃、23℃和27℃刺激, Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度, 且23℃刺激, Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度; Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度。Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异, Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌。原位杂交技术结果显示, Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中。综上所述, 温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化, 27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象, 23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转; 并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量, 从而调节生殖滤泡分化的。     

池蝶蚌Sox2 基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox 基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用, 为研究池蝶蚌中Sox 基因的功能, 以人SRY基因HMG-box 保守区的序列设计简并引物, 以雌、雄池蝶蚌基因组DNA 和精巢cDNA 为模板进行扩增, 获得了2 个不完全相同的序列, 分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2 和cDNA-HMG, 长度均为220 bp, 编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3 及Sox14 有很高的同源性, 雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR 扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2 部分cDNA 片段, 长度为1774 bp, 该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2 的同源性最高; 在部分开放阅读框249 个氨基酸残基中, 具有Sox 家族典型的HMG-box 结构域, 与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2 的HMG-box 同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR 方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8 种组织hs-Sox2的表达情况, 结果显示, hs-Sox2 基因在8 种组织中均有表达, 其中在肾脏中的表达量最高, 其次是肠与闭壳肌, 在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺, 在肝脏中的表达量最低; 为了解hs-Sox2 在不同性腺发育时期的表达情况, 采用实时荧光定量PCR 方法分析了5 个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2 的表达情况, 结果显示在39 月龄性腺的表达量最高, 其次是16 月龄性腺, 63 月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明, hs-Sox2 基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。       

三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A (Cyclophilin A, CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp, 3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸, CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MO...     

池蝶蚌IκBα和c-Rel的结构特征及在LPS刺激下的表达分析

为研究淡水贝类NF-κB/Rel信号通路中核因子κB(Nuclear factor-κappaB, NF-κB)和NF-κB抑制因子(Inhibitors of NF-κB, IκB)的功能,对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)IκBα和c-Rel(以下简称HsIκBα和Hsc-Rel)的序列结构、表达特征及Hs IκBα和Hsc-Rel之间的相互关系进行了分析。结果表明, Hs IκBα的c DNA全长为1783 bp,其开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1083 bp,编码360个氨基酸。Hsc-Rel的cDNA为2414 bp, ORF为2298 bp,编码765个氨基酸。通过构建HsIκBα-ORF-GST和Hsc-Rel-RHD-HIS重组质粒、原核诱导表达和纯化,进行GST-pull down,通过SDS-PAGE和Western Blot检测研究,发现HsIκBα和Hsc-Rel-RHD存在直接的相互作用。通过对池蝶蚌进行脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激后,分别在7个时间点(0、6h、12h、24h、...     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸, ORF中含有一个S＿TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、內褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中, T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明, Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳...     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

无苞芥NAC转录因子基因OpNAC026的克隆与分析

在新疆耐逆植物无苞芥幼苗cDNA文库的随机克隆测序结果中,发现1条与拟南芥NAC转录因子基因AtNAC026高度相似的5′端EST序列(GenBank登录号为JZ151854),对该克隆进行3′端测序,拼接得到一条全长1 327bp的cDNA序列,该序列包含一个906bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码301个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术对其进行克隆,将该基因命名为OpNAC026(GenBank登录号为KM457621)。理化性质分析表明,OpNAC026蛋白是一个无跨膜区域的亲水蛋白,在N端具有一段保守结构域;蛋白质二级结构预测显示,OpNAC026蛋白包含54个α-螺旋和12个β-转角。系统进化树分析表明,OpNAC026基因与拟南芥AtNAC026和AtNAM进化关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,OpNAC026基因在无苞芥的各组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理24h、干旱12h、ABA 6h、4℃低温8h处理均可明显诱导OpNAC026基因的表达。研究表明,OpNAC026基因可能参与无苞芥抗逆机制的调控。     

池蝶蚌线粒体基因组双单性遗传现象分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式不同于标准的母系遗传(SMI),被称为双单性遗传现象(DUI)。池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是淡水双壳贝类,是否存在双单性遗传现象?本文采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序及软件拼接获得了雄性池蝶蚌线粒体基因组(以下简称Hs-mtDNA)全序列,并与本实验室已报道的雌性池蝶蚌线粒体基因组全序列进行差异性分析。结果表明,雄性和雌性Hs-mtDNA全长分别为15961 bp和15939 bp,雄性比雌性长22 bp,雌雄线粒体基因组成与排列顺序一致。各蛋白编码基因的碱基数目均一致,碱基转换率为1.01%～7.34%,颠换率为0.00%～0.62%,氨基酸差异率为0.00%～9.35%;其中,COX1基因变异率为2.72%;COX2基因碱基变异率最高,达7.50%,雄性COX2的3'末端没有出现编码延伸区。雄性12S rRNA基因发生5 bp的碱基转换,差异率为0.6%;16S rRNA基因比雌性长9 bp,碱基差异率仅为1.2%。雌雄tRNA-His均位于H链上,介于COX2与ND3之间,没有出现位置的差异性。雌雄Hs-mtDNA的非编码区共有28个1～393 bp的片段,但未见控制区。在tRNA-Glu与tRNA-Tyr间有一段长393 bp的非编码区存在蛋白质翻译功能,但非雄性特异性蛋白。以COX1基因建立系统进化树,池蝶蚌和三角帆蚌(H.cumingii)聚在一起,而含有双单性遗传现象的无齿蚌属的Pyganodon grandis、小方蚌亚科的Venustaconcha ellipsiformis及小方形蚌属的Quadrula quadrula三者雄性聚为一支,雌性聚为一支。因此,雌雄池蝶蚌线粒体存在一定的差异性,但其差异要比其他具有双单性遗传现象的淡水双壳类小得多,且池蝶蚌线粒体遗传可能不存在双单性遗传现象。     

珠子参β-香树素合成酶基因的克隆和生物信息学分析

β-香树素合成酶(beta-amyrin synthaseβAS)是定向分流齐墩果烷型皂苷和达玛烷型皂苷的限速酶,对药用植物三萜皂苷的生物合成具有重要的调控作用。基于珠子参转录组数据中βAS转录本序列设计引物,利用RT-PCR方法从珠子参根状茎中克隆得到βAS基因全长c DNA序列,命名为pjβAS。经测序鉴定该基因长度为2 655 bp,包含一个2 286 bp的完整开放阅读框,编码761个氨基酸,在Gen Bank数据库的登录号为KX254566。生物信息学分析显示,其编码蛋白分子量为87.90 k D,理论等电点(p I)5.84,不含跨膜区,为非分泌蛋白,含有38处磷酸化位点,主要于叶绿体和内质网中发挥生理作用;二级结构预测发现其α-螺旋占39.82%、延伸链16.56%、β-转角10.38%、无规则卷曲33.24%,具有DCTAE、QW(QXXXXXW)和MWCRCY3个氧化鲨烯环化酶(OCS)基因家族特征保守基序;pjβAS蛋白与竹节参(AKN23431.1)序列的一致性为100%,系统进化分析中与竹节参(AKN23431.1)、西洋参(AGG09939.1)、柴胡(ABY90140.2)划为同一分支。通过实时荧光定量PCR分析pjβAS在珠子参不同组织中的相对表达量,发现pjβAS基因在花、叶、茎、根状茎中均有表达,在叶中表达量最高,根状茎中表达量最低。     

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A),分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp, 5′端非编码区68 bp, 3′端非编码区108 bp,开放阅读框399 bp,编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高,与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示,PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01),而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示, PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达,其中初级卵母细胞中表达信号最强,且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后,目的信号逐渐减弱,并且主要在核周区域表达。此外, PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上,研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。     

三角帆蚌组织蛋白酶L基因的克隆和序列特征与进化分析

组织蛋白酶L在多种生理过程中具有重要作用.根据本实验室构建的三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE方法克隆了三角帆蚌组织蛋白酶L基因的cDNA全序列(GenBank登录号为HQ610996).结果表明,该序列全长为1 105 bp,包括24 bp的5'-末端非转录区,1 002 bp的开放阅读框和79 bp的3'-末端非转录区,共编码333个氨基酸,包含1个由20个氨基酸组成的信号肽.推测的三角帆蚌组织蛋白酶L前体肽具有组织蛋白酶前体抑制因子功能结构域,具有组织蛋白酶L家族高度保守结构基序ERFNIN[E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]、GNFD和GCXGG;该蛋白的半胱氨酸类蛋白酶半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸活性位点均高度保守.同源性分析表明,推测的三角帆蚌组织蛋白酶L氨基酸序列与其他贝类高度保守,同源性在60%-74%之间.进化分析显示,三角帆蚌组织蛋白酶L与其他贝类组织蛋白酶L聚为一支,在该支中,三角帆蚌与软体动物淡水螺(R.peregra)的亲缘关系最近.本研究结果为进一步研究三角帆蚌组织蛋白酶L的生理功能提供基础资料.