鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆及表达载体的构建

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase(KAO)基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再将该基因连接到p ET-28a表达载体中。结果显示,成功克隆出的鞘蕊苏KAO基因大小为1 500 bp,对克隆基因进行测序及酶切鉴定,均得到正确大小的DNA片段,说明表达载体构建成功。本研究成功克隆得到鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因并构建其表达载体,为提高鞘蕊苏有效成分含量提供了基础。     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

马铃薯腐烂茎线虫L 型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因Dd-cpl-1 (GenBank登录号为GQ180107)。该基因Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有1个1 131 bp的开放性阅读框 (ORF),编码376个氨基酸残基,其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区 (UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含7个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源,一致性达到77％。以不同物种中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,推测推定的蛋白 Dd-CPL-1含有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体 (Cys183,His322 和Asn343) 以及ERFNIN基系和GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明,Dd-cpl-1 属于由L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶,为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。     

盐藻PDS基因的同源克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】八氢番茄红素脱氢酶PDS为真核膜结合蛋白,我们通过更换不同的表达策略,探索在大肠杆菌中表达真核膜结合蛋白的方式。【方法】利用RACE的方法克隆盐藻PDS的全长c DNA序列。利用原核表达载体p ET-28a构建p ET-28a-PDS表达载体;使用PLtac启动子替换T7启动子构建p ET-PLtacPDS表达载体;合成Mistic序列融合入p ET-28 a中构建了p ET-Mistic-PDS融合表达载体。分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。【结果】获得了盐藻PDS基因的全长c DNA序列2237 bp,开放阅读框为1749 bp,共编码582个氨基酸(NCBI登录号为GQ923693.1)。利用p ET-28a-PDS和p ET-PLtacPDS表达的PDS蛋白表达量低,并以包涵体形式存在;利用p ET-Mistic-PDS载体表达的PDS蛋白表达量明显提高,且大部分以可溶蛋白形式存在,具有脱氢酶活性。【结论】实验结果表明Mistic作为促溶标签能促进膜蛋白的正确折叠,提高蛋白的可溶性。蛋白酶活测定结果证明了Mistic的融合可以保持蛋白的天然活性。     

藏鸡GPX3基因的克隆、组织表达谱研究及功能预测

本研究对藏鸡GPX3基因进行克隆和生物信息学分析，检测其在藏鸡不同组织中的表达量，鉴定GPX3互作蛋白的mRNA表达水平并分析其相关性，为进一步探究GPX3基因对藏鸡免疫功能的影响奠定基础。本试验以70日龄健康藏鸡（公鸡）作为研究对象，利用RT-PCR技术获得GPX3基因CDS序列并进行生物信息学分析；利用qPCR技术检测GPX3基因在藏鸡心、肝、脾、肺和肾组织中的表达差异情况以及分析可能与GPX3蛋白存在互作关系的10个相关蛋白在脾中的mRNA表达情况及其相关性。结果显示，成功扩增藏鸡GPX3基因799 bp，包括5’UTR 78 bp,CDS区660 bp,3’UTR 61 bp，可编码219个氨基酸。GPX3mRNA在藏鸡5个组织中均有表达，且在脾中表达量最高，预测GPX3基因在脾中表达量最高这一结果可能与该蛋白的免疫功能有关。GPX3蛋白与预测互作蛋白SOD2呈极显著正相关，推测GPX3在耐药性、生殖调控等方面存在一定的调节作用。本研究成功克隆藏鸡GPX3基因CDS区660 bp，预测其可能与SOD2呈极显著正相关。为进一步了解GPX3基因的抗氧化功能在藏鸡免疫机制中的作用提供...     

不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白

霍乱毒素由5个B亚基(CTB)和l个A亚基(CTA)(包括CTA1和CTA2)组成。该蛋白结构可帮助有毒的CTA1分子进入细胞。本研究拟利用原核不相容双质粒共表达系统获得霍乱毒素类似嵌合蛋白,用于大分子蛋白质黏膜给药的载体研究。将CTB基因片段克隆至载体p ET-28a中,获得重组质粒p ET-28a-CTB;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)代替有毒的CTA1,在CTA2序列N端融合穿膜肽(TAT),将EGFP-CTA2-TAT基因克隆至载体p ET-22b(+)中,获得重组质粒p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT。利用p ET-28a-CTB和p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。表达条件为0.75 mmol/L IPTG、20℃、200 r/min诱导20 h,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质特异性进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。     

松材线虫galectin-1基因的克隆、原核表达和表达模式分析

【目的】galectin-1是凝集素的一种,广泛存在于各种生物体内,在生长发育、免疫调节方面起重要作用。本研究克隆和表达了松材线虫的galectin-1蛋白,并分析了各个龄期的表达量。【方法】设计引物,扩增松材线虫的galectin-1基因,使用双酶切的方法连接p ET-28a载体和目的基因,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆;在不同温度下,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检验蛋白表达情况;采用RT-PCR技术检验松材线虫各个龄期galectin-1基因的表达情况。【结果】由SMART和Predict Protein软件分析可知,该蛋白有2个结构域,并且主要由无规卷曲和β折叠构成;生物学信息分析显示,松材线虫的galectin-1与小卷蛾斯氏线虫的相似性更高;与日本血吸虫相比,线虫能很好地聚集在一个分支上。Western blot检测纯化蛋白大小与查询所得蛋白分子质量一致。RT-q PCR结果显示,以繁殖型2龄松材线虫(L_2)为对照,galectin-1基因在繁殖型3龄(L_3)、繁殖型4龄(L_4)、扩散型3龄(L_(Ⅲ))和扩散型4龄(L_(Ⅳ))松材线虫中的表达量高,尤其是在LⅢ中的表达量最高;雌雄成虫没有显著性差异。【结论】松材线虫的galectin-1基因在p ET-28a原核表达系统中呈可溶性表达,在不同龄期的表达量有差异。本研究为进一步研究松材线虫的galectin-1基因奠定了基础,为松材线虫的防治提供了新的方向。     

四价抗马铃薯病毒植物表达载体构建及其对烟草的转化

该研究为了培育兼抗4种病毒的马铃薯品种,采用RT-PCR技术对PVX、PVS、PVY和PLRV的外壳蛋白(CP)基因进行克隆与分析,获得了大小分别为670、800、700、600 bp的CP基因序列,将获得的CP基因序列与NCBI中已报道的序列进行比对分析,其同源性都在96%以上。根据所克隆的CP基因对靶标片段进行筛选,获得了大小约300 bp的靶标片段PVX-rh、PVS-rh、PVY-rh和PLRV-rh,同时利用Overlap-PCR技术将4种病毒的靶标片段进行拼接,得到了长度约为1 200 bp的融合片段XSYV-rh,与预期目标片段XSYV-yxz的相似性达100%。利用DNA重组技术将融合片段XSYV-rh克隆到p GM-T载体上构建成克隆载体p GM-T-XSYVrh,用SpeⅠ和SacⅠ对克隆载体p GM-T-XSYV-rh和植物表达载体p ART27进行同步双酶切,用T4 DNA连接酶将XSYV-rh片段连接到载体p ART27上,成功构建了同时含4种病毒CP基因片段的植物表达载体p ART27-XSYV-rh。采用直接转化法将植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,并利用农杆菌介导法对烟草品种T12试管苗进行遗传转化,转化后的烟草植株经PCR检测,有40株转化植株可扩增出目的条带,表明XSYVrh融合基因已成功转入烟草基因组中。     

小麦冰重结晶抑制蛋白基因TaIRI5的克隆及分析

为了明确小麦冰重结晶抑制蛋白基因(TaIRI5)在小麦生长发育过程中的作用,该研究以小麦品种‘北京841’为材料,利用RT-PCR方法克隆TaIRI5基因,并对该基因进行生物信息学分析、组织特异性表达分析、启动子活性分析以及亚细胞定位分析。结果显示:(1)成功克隆到TaIRI5基因,该基因全长1203 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,蛋白质分子量为70.7 kD,等电点为5.07,属于疏水性蛋白。(2)实时荧光定量PCR结果显示,TaIRI5基因在小麦的根、茎、叶片、雌蕊、雄蕊、护颖、种子中均有表达,其中根部的相对表达量最高,在雌蕊中表达量最低,表明该基因在小麦的生长发育过程中起重要作用。(3)TaIRI5基因的启动子分析表明,该区域除CAAT-box和TATA-box启动子核心元件外,该序列还包含9个光响应元件和6个激素应答元件及其他元件;利用TaIRI5基因不同长度(498 bp、999 bp、1500 bp)的3个候选启动子,构建了含有GUS基因的pCAMBIA1301融合表达载体;烟草转化实验表明,3个候选启动子都能启动该基因的表达,但表达模式略有差异。(4)成功构建含有GFP基因的融合载体pCAMBIA1300-TaIRI5-GFP,亚细胞定位结果显示,TaIRI5定位于细胞膜上。该研究结果为进一步研究小麦TaIRI5基因功能奠定了基础。     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。