高产谷胱甘肽酵母菌株的选育及其代谢通量分析

利用UV和HNO2及其复合诱变处理S.cerevisiae 的原生质,筛选得到ZnCl2和半胱氨酸抗性菌株S.cerevisiae YZM-14(ZnCl2r,Cysr),其谷胱甘肽(GSH)产量(84.72mg/L)、生物量(7.63g/L)及胞内GSH含量(11.10mg/g)分别是出发菌株的2.79倍、1.63倍和1.71倍,且性状稳定。根据细胞比生长速率和GSH得率变化曲线,将GSH生物合成过程分为三个阶段,第二阶段诱变菌株与出发菌株相比PP途径代谢通量增加8.1 mmol/(g·h),GSH前体合成途径通量增加,且诱变菌株的有机酸分泌通量减少,提高了细胞的碳源利用效率,增大了GSH的生成。     

高产谷胱甘肽酿酒酵母的选育及发酵工艺的研究

以酿酒酵母SC-001为出发菌株,利用紫外诱变结合乙硫氨酸和氯化锌的底物选择筛选到1株有较高GSH产量的酿酒酵母菌株SC-001-24,其GSH产量为743 mg/L,比出发菌株提高了22%。进一步在10 L发酵罐中考察了不同发酵模式和前体氨基酸补加方式对酿酒酵母产GSH的影响,确定最佳发酵模式为补料分批发酵,最佳前体氨基酸补加策略为:初始培养基加入41 mmol/L半胱氨酸,发酵42 h后一次性补加半胱氨酸246 mmol,甘氨酸160 mmol,谷氨酸82 mmol。在最佳发酵条件下GSH产量达到1 280.4 mg/L。     

基因工程酶法生产谷胱甘肽的工艺研究

研究了前体氨基酸和辅因子对基因工程酶法生产谷胱甘肽(GSH)的影响.实验考察了不同浓度的前体氨基酸和不同的镁离子浓度对于重组大肠杆菌酶法生产GSH产量的变化.实验结果表明,当L-Glu 60 mmol·L-1;Gly 50 mmol·L-1;L-Cys 15 mol·L-1;Mg2+ 80 mmol·L-1为酶法生产谷...     

具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程

以野生型大肠杆菌E.coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coliⅡ\|1。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E.coliⅡ\|1细胞控制的GSH合成反应机理：由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSHⅡ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3 h后,GSH产量达到230mmol/L(约71g/L)。     

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。     

生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建

利用重组大肠杆菌Ⅱ 1中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH J7中的ATP生物合成酶系 ,构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加 1mmol/LAMP和 0 0 5mmol/LNADH ,即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度 ,可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为 40 0mmol/L时 ,系统内GSH浓度达到 1 0 4mmol/L(3 2 g/L)。Mg2 +缺乏时 ,耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2 +与ATP形成螯合物 ,可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2 +,反应 6h时GSH浓度达到 1 4 3mmol/L(4 4g/L)。     

解淀粉芽胞杆菌hemX基因缺失对血红素合成的影响

血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR...     

化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵产丁醇的影响

旨在研究化学改性的甘蔗渣作为固定化载体对丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum XY16发酵制备生物丁醇的影响。首先利用不同浓度的聚乙烯亚胺(PEI)和1 g/L戊二醛(GA)对甘蔗渣表面进行化学改性,增强甘蔗渣对Clostridium acetobutylicum XY16的附载能力。经4 g/L聚乙烯亚胺和1 g/L戊二醛改性的甘蔗渣(添加量10 g/L)应用到固定化批次发酵中,发酵36 h后丁醇和总溶剂浓度最高,分别达到了12.24 g/L和21.67 g/L,同时溶剂的生产速率达到0.60 g/(L·h),生产速率比游离细胞和未改性甘蔗渣固定化细胞分批发酵分别提高了130.8%和66.7%。在此基础上对改性甘蔗渣固定化的细胞进行6次重复批次发酵,丁醇和总溶剂的产量稳定,溶剂生产速率逐渐提高至0.83 g/(L·h),同时转化率也提高至0.42 g/g。     

谷胱甘肽促进液体发酵体系中蛹虫草合成虫草素

虫草素是药用真菌蛹虫草Cordyceps militaris的主要活性成分,具有抗癌、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性。研究表明,氧化应激参与丝状真菌的次级代谢调控,然而在蛹虫草虫草素代谢中尚未见报道。本研究以蛹虫草深层液体发酵体系为研究对象,添加谷胱甘肽（glutathione,GSH）调节细胞氧化还原状态,考察其对虫草素代谢的影响。添加3.0g/L GSH,发酵20d虫草素产量达到(439.69±12.43)mg/L,较无添加对照组提高471.24%,同时谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）活力提高414.82%;基因表达分析显示,添加GSH后虫草素生物合成关键基因Cns1和Cns2表达显著上调,发酵第15天其表达量分别是对照组的540.67倍和25.81倍。研究结果初步证实,氧化应激参与蛹虫草中虫草素代谢调控。     

γ-谷氨酰转肽酶补料法合成L-茶氨酸工艺研究

对γ-谷氨酰转肽酶酶法制备L-茶氨酸的工艺进行优化。通过恒速补料的策略,以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺盐酸盐作为初始底物,37℃、p H10.0条件下反应,每2 h补加100 mmol L-谷氨酰胺,反应14 h,最终L-谷氨酰胺底物总浓度为900 mmol/L,L-茶氨酸的生成量达到573.2 mmol/L,转化率达到63.7%,生产强度为40.9 mmol/(h·L)。采用变速流加的工艺,以同样的初始条件进行反应,每2 h补加L-谷氨酰胺至初始浓度200 mmol/L,反应15 h,最终L-谷氨酰胺总浓度为600 mmol/L,L-茶氨酸的生成量达到445.8 mmol/L,转化率为74.3%,生产强度为29.7 mmol/(h·L)。     

Forms of the Word and the Mystery of the Objectified Nature of the Word

The time has come to proceed from forms of givenness of the word to forms of the word as such. They can, if you like, be called external and inner structures. Humboldt, however, preferred to speak of the external and inner forms of the language. Shpet adopted precisely this distinction. Why did this problem interest Shpet? Already in [Appearance and sense], he had set the task of returning to the source of pretheoretical, living science. Shpet wrote that the outer cover of words and logical expressions obscure the objectified meaning and that it was necessary to remove another cover from the objectified sign so as to grasp a certain genuine intimacy, and in it the fullness of being (Shpet, 1914. Pp. 5-6). We shall keep in mind this major undertaking posed by this scientist. The existence of the inner form of words should not come as a surprise. That same year (1914) Ortega y Gasset wrote that material objects have a third dimension. However, we cannot see or touch it: "For just as depth needs a surface beneath which to be concealed, the surface, or outer cover, in order to be so, needs something over which to spread, covering it" (Ortega y Gasset, 2000. Pp. 62-63).