牦牛FAF1基因的分子特征及其在不同阶段卵巢、输卵管、子宫中的表达

FAF1(Fas-associated factor-1)在多种细胞中可与Fas蛋白结合,介导细胞凋亡的启动,其基因突变可导致分裂期胚胎死亡。旨在探索牦牛FAF1基因的分子特征及其在不同阶段的生物学作用。试验选取雌性牦牛3个不同时期(卵泡期、黄体期和妊娠期第3个月,以下将妊娠期第3个月简称为妊娠期)的卵巢、输卵管和子宫,克隆牦牛FAF1基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组织化学和Western blot(WB)方法对其基因和蛋白的表达水平进行检测和定位。成功克隆出牦牛FAF1基因的编码区(CDS),长度为1 953 bp(GenBank登录号:MK416195),编码650个氨基酸,基因特征分析显示该基因具有高度保守性,其编码的蛋白为含5个蛋白结合位点的非跨膜、可溶性蛋白,主要分布于细胞核(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞质(13.0%)、高尔基体(4.3%)、细胞骨架(4.3%)。qRT-PCR结果显示:卵巢中FAF1基因在卵泡期表达最高,妊娠期次之,黄体期最低;输卵管中黄体期最高,子宫中卵泡期最高,妊娠期次之,黄体期最低;蛋白水平显示:妊娠期输卵管和子宫FAF1蛋白相对表达量显著高于卵泡期和黄体期,卵巢在黄体期的表达量最高,卵泡期次之,妊娠期最低。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)结果显示不同阶段FAF1蛋白在同一组织中表达部位并无明显的差异,在卵巢中主要表达部位为卵巢生殖上皮、颗粒细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞(黄体期);在输卵管中主要表达部位为黏膜上皮细胞;在子宫中主要表达部位为子宫内膜细胞、子宫腺。FAF1基因和蛋白的表达存在显著差异,揭示其对牦牛的生殖生理调控具有重要意义。     

牦牛Atg5基因克隆及其在输卵管、卵巢和子宫中的表达定位

自噬是一种保守的细胞内降解过程,在多种生物体内证实自噬有重要的生物学意义。但是自噬在牦牛这一高原特色物种体内的研究未见报道。因此为探索正常生理条件下自噬相关基因在牦牛生殖过程中的表达,本研究分别采集牦牛不同繁殖周期（卵泡期、黄体期及妊娠期）的主要生殖器官（输卵管、卵巢、子宫）,克隆牦牛自噬相关基因5（Autophagy related 5,Atg5）基因并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测Atg5 基因在组织中的相对表达量;并采用蛋白质免疫印迹（Western-blot, WB）检测Atg5和Atg5-Atg12（Autophagy related 12,自噬相关基因12）复合体在不同组织中的表达水平;免疫组织化学方法分析Atg5在各生殖器官中的分布特征。结果显示,成功克隆牦牛Atg5基因在进化过程中高度保守,编码的蛋白质为可溶性的非跨膜蛋白;qRT-PCR和WB检测结果显示Atg5和Atg5-Atg12复合体在牦牛输卵管、卵巢和子宫中均有表达。其中卵泡期卵巢Atg5-Atg12表达显著高于黄体期和妊娠期,卵泡期Atg5的表达却显著低于黄体期和妊娠期;黄体期输卵管Atg5-Atg12表达量显著高于卵泡期和妊娠期,妊娠期输卵管中Atg5的表达量显著高于卵泡期和黄体期;卵泡期和妊娠期子宫中Atg5-Atg12的表达量显著高于黄体期,而黄体期子宫中的Atg5的表达量又显著高于妊娠期和卵泡期,在蛋白水平上Atg5和Atg5-Atg12的表达呈负相关。免疫组织化学结果显示Atg5在输卵管黏膜上皮,卵巢卵泡膜、颗粒层、生殖上皮、黄体细胞,子宫内膜和子宫腺体均有表达。研究结果表明自噬在牦牛体内与其他物种相似具有保守性,通过检测Atg5-Atg12复合体在牦牛生殖器官中的表达,推测自噬可能参与牦牛生殖生理过程的调控。该研究结果对自噬在其他大型哺乳动物以及高寒低氧环境中动物的研究具有借鉴意义,有助于自噬参与其他动物生殖生理作用机制的研究。       

牦牛TNFAIP6基因克隆及其在卵巢活动中的时序表达

旨在探讨牦牛TNFAIP6基因的序列特征,比较分析其在牦牛不同组织以及发情周期卵巢中的时序表达差异性。采集健康雌性牦牛的心脏、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、子宫、小肠、胃、肌肉和不同发情期的卵巢组织,提取各组织总RNA和总蛋白,通过RT-PCR技术克隆获得牦牛TNFAIP6基因序列并对其进行生物信息学分析,用半定量PCR检测其在牦牛不同组织中的表达水平,Western blot和qRT-PCR法分别检测其在不同发情期牦牛卵巢中的蛋白和mRNA表达水平,并进行统计学分析。克隆获得牦牛TNFAIP6基因CDS区全长830 bp,共编码279个氨基酸。蛋白质分析显示,TNFAIP6蛋白为亲水酸性稳定蛋白,无跨膜结构但有信号肽,其中包含Link和CUB两个结构域,其二级结构和三级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成。通过同源性比对分析,发现牦牛TNFAIP6基因与野牦牛和黄牛的同源性较高。半定量PCR结果显示,TNFAIP6基因在牦牛各组织中均有表达,其中在卵巢、子宫、脾脏和肌肉组织中表达显著高于其他组织。qRT-PCR结果显示,TNFAIP6基因在卵泡期卵巢中的表达水平极显著高于其他两个时期(P0.01),而红体期与黄体期的表达水平差异不显著(P0.05)。Western blot结果与qRT-PCR结果基本一致。提示TNFAIP6基因可能参与牦牛卵巢活动调控,为进一步探讨TNFAIP6基因在牦牛卵巢活动中的作用机制提供基础资料。     

母牦牛生殖系统中低氧诱导因子基因的表达分析

低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)和2α(Hypoxia-inducible factor 2α,HIF-2α)是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境的核心调节因子,为了研究生活在青藏高原牦牛的繁殖机能对低氧环境的适应机制,采集卵泡期的5头成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫组织,利用RT-qPCR技术检测HIF-1α和HIF-2αm RNA的表达量。结果表明:HIF-1αmRNA在牦牛输卵管中表达量最高,牦牛脑垂体和输卵管表达量极显著高于黄牛(P0.01)。HIF-2αmRNA在牦牛脑垂体表达量极显著高于黄牛(P0.01),在输卵管表达量显著高于黄牛(P0.05)。说明在低氧环境条件下,母牦牛可能通过调节生殖生殖系统中HIF-1α和HIF-2α基因的表达维持其繁殖机能。     

牦牛DBI基因的分子特征及其在乳腺组织中的表达与定位

地西泮结合抑制因子(Diazepam binding inhibitor,DBI)与酰基辅酶A具有高亲和力,在动物组织中广泛存在,与脂肪酸代谢、类固醇激素合成密切相关。为研究DBI基因的分子特征及该基因在乳腺发育中的作用,对牦牛DBI基因编码区进行克隆,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法对牦牛泌乳前期、泌乳期和干乳期的乳腺组织中DBI的相对表达量和表达部位进行研究。DBI序列分析显示：牦牛DBI基因编码区序列长264 bp,编码87个氨基酸残基,与牛的同源性高达99.62％;qPCR数据表明：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI基因的相对表达量显著高于泌乳期和干乳期(P< 0.05);WB结果显示：牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI蛋白的表达量最高,干乳期次之,泌乳期最低(P< 0.05);IHC结果表明：不同发育时期的牦牛乳腺组织中DBI的表达部位并无明显差异,主要表达于乳腺腺泡上皮细胞、导管上皮细胞及小叶间质细胞。DBI在不同发育时期牦牛乳腺组织中的相对表达量具有明显差异(P< 0.05),揭示DBI可能参与牦牛乳腺发育的过程,这为进一步探究DBI基因在生物体中的作用提供相应的理论参考。     

牦牛不同组织TLR3、TLR5 mRNA转录水平相对定量研究

参考牦牛TLRs基因序列设计荧光定量PCR特异性引物,建立检测牦牛TLRs相对表达量的荧光定量PCR方法,分析TLR3及TLR5基因在牦牛不同器官组织中的转录水平。结果显示两基因具有不同的表达谱及表达量,其中TLR3基因除在乳腺组织外,在其它组织器官中均有转录,其中在心、大肠、胃和肌肉组织中表达量较高;TLR5基因则在心、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、卵巢组织中具有较高的表达量。该试验结果表明,TLRs在不同组织器官转录水平差异较大,可能与其对病原体的识别有关;同一个基因在不同组织中存在差异性,这可能与基因作用机理相关。     

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

旨在对牦牛CAV-3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据Gen Bank数据库中已知的黄牛CAV-3基因的m RNA序列并设计特异性引物,应用RT-PCR技术克隆牦牛CAV-3基因的编码区。运用生物信息学方法,分析并预测牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量PCR技术检测CAV-3基因m RNA在牦牛和黄牛各组织中的表达;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因m RNA表达水平。牦牛CAV-3的编码区全长631 bp,共编码151个氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达,仅在心脏和肌肉组织中表达,且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织,CAV-3基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织,但差异不显著(P0.05)。     

牦牛TSHB、DIO2和DIO3基因的克隆及其在繁殖轴的表达研究

为了解TSHB-DIO2/DIO3系统对牦牛季节性发情的调控机制,以牦牛为研究对象,运用RT-PCR方法克隆牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的cDNA序列,结合GenBank已公布的普通牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列,构建遗传进化树,采用荧光定量PCR技术检测其在牦牛下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫中的表达水平。结果表明,牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因均与普通牛有最近的分子进化关系;TSHB基因CDS区为417 bp,在垂体中的表达水平高于其他组织,差异极显著(P0.01);DIO2基因cDNA为951 bp,在所检测的组织中均有表达,且在子宫中的表达水平高于其他组织,差异极显著(P0.01);DIO3基因cDNA为873 bp,在子宫组织中未检测到表达,在卵巢中的表达水平高于垂体、下丘脑和输卵管,差异极显著(P0.01)。提示TSHBDIO2/DIO3可能参与牦牛繁殖调控,旨为揭示牦牛季节性繁殖分子调控机制提供参考。     

团头鲂生长相关基因在不同发育时期生长轴组织的表达分析

为了探讨生长相关基因对团头鲂生长发育的调控, 研究采用Real-time PCR的方法定量分析了团头鲂6个生长相关基因在其不同生长发育阶段(3、6、12月龄)相关组织(脑、肝脏、肌肉)的表达情况, 并比较了这些基因在生长快和慢两个群体的表达差异. 结果显示: GHRs基因在肝脏与肌肉中的表达量高于脑, 在6月龄表达量高于3月龄与12月龄, 生长快群体中的表达量高于生长慢群体(P0.05); IGFs基因在三个组织中均有表达, 肝脏表达量最高, 生长快群体中的表达量高于生长慢群体(P0.05). MSTN a与MSTN b基因在组织中表达模式存在差异, MSTN a在肌肉中高表达, MSTN b主要在脑与肝脏中表达. HCL聚类结果表明: 除了MSTN a基因外, 其他5个基因在生长差异的两个群体中表达量均分别聚为一支. 不同时期组织表达聚类结果表明, 除了3月龄肝脏与12月龄肌肉组织, 6个生长相关基因在不同时期的同一组织中的表达模式存在相似性. Pearson相关分析显示: GHRs与IGFs呈正相关, MSTN a基因与GHR 2、IGFs基因呈负相关, 相同基因在两个群体中呈极显著相关(P0.01).       

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

以牦牛血小板活化因子受体(Platelet-activating factor receptor,PAFR)基因为研究对象,采取西宁家养牦牛子宫为材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因,对其进行生物信息学分析,并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明,牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp,编码342个氨基酸;氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%,与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%,表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性;其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域,推测其可能为跨膜蛋白;具有亲水性;未发现信号肽片段;含有G蛋白偶联受体家族结构域;QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达,妊娠期最高,卵泡期最低,黄体期居中,揭示其与胚胎附植,妊娠维持有关。