耐热羧肽酶Taq基因在毕赤酵母中的表达

为了获取表达羧肽酶Taq毕赤酵母工程菌,通过密码子优化,依据毕赤酵母密码子偏爱性,在体外合成了栖热水生菌的耐热羧肽酶Taq基因。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体p HBM905A上并引入6×His标签,构建了重组质粒p HBM905A-Cpase Taq。将该重组质粒转化毕赤酵母GS115,经1%甲醇诱导表达72 h,酶产量达0.1 mg/m L。对纯化的重组酶进行酶活性分析表明在75℃,p H为7.5时,该酶比酶活性为80 U/mg。本研究首次证明了羧肽酶Taq能在毕赤酵母中有效分泌表达,可以被大量制备,进而为多肽水解为氨基酸奠定工业基础。     

深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究

从深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO03032基因组中扩增到1条含淀粉结合域的水解糖苷13家族基因amy032,该基因编码氨基酸与已知蛋白一致性最高为67%。将amy032插入表达载体pET32a启动子下游,构建重组载体pET-amy。重组质粒导入大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株中,SDS-PAGE分析结果显示目的基因成功实现异源表达。Ni-NTA对重组酶进行纯化,并对其酶学性质进行表征。结果表明:重组淀粉酶AMY032的最适作用温度为50℃,最适pH为8.0,以可溶性淀粉为底物时的比酶活为(276±57)U/mg,Km为0.02g/L,Vmax为70mg/(L·min)。Ca2+能提高该酶的催化活性,Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+对该酶有抑制作用。AMY032对生玉米淀粉和生大米淀粉具有水解活性,其比酶活分别为(49±12)U/mg和(39±11)U/mg;扫描电镜结果显示AMY032使生玉米淀粉的表面产生明显凹陷。     

蜡样芽胞杆菌GXBC-3三个普鲁兰酶基因的表达及其酶学特性

探索获得优良的新型普鲁兰酶基因,丰富普鲁兰酶理论,对实现普鲁兰酶国产化具有重要意义。分析GenBank数据库中蜡样芽胞杆菌假定Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶基因序列,从实验室保藏的蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus GXBC-3中克隆得到3个普鲁兰酶基因pulA、pulB、pulC,并分别导入大肠杆菌进行胞内诱导表达。纯化重组酶酶学性质研究表明重组酶PulA能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷键,为Ⅱ型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,最适反应温度及pH分别为40℃和6.5,比活力为32.89 U/mg;以可溶性淀粉为底物时,最适反应温度及pH分别为50℃和7.0,比活力为25.71 U/mg。重组酶PulB和PulC二者均只能水解α-l,6-糖苷键,为I型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,其最适反应温度及pH分别为45℃、7.0和45℃、6.5,比活力分别为228.54 U/mg和229.65 U/mg。     

4株海洋酵母菌胞外酶活力及其对水产养殖有机污染物的降解

研究利用平板鉴别培养基法观察比较4株海洋酵母菌生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等胞外水解酶的能力,并进一步分析测定其酶活性。结果表明, 圆丘假丝酵母菌 (Candida.colliculosa)DY11-1能产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶, 其酶活力分别为181.4 U/mL、123.1 U/mL和36.7 U/mL;毕赤酵母(Pichia sp)DY11-6和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)DY07-1都能产生淀粉酶和蛋白酶, 它们淀粉酶的活力分别为108.1 U/mL和96.5 U/mL, 蛋白酶的活力分别是35.1 U/mL和128.4 U/mL;粘红酵母(Rhodotorula glutinis)DY02-3四种胞外酶皆无。以罗非鱼(Tilapia mossambica)饲料浸出液作为养殖有机污染物, 分析比较4株酵母菌对其的降解率。结果显示, 圆丘假丝酵母DY-11-1菌株对饲料浸出液的COD、总氮、总磷降解能力最高, 9 d后分别由27.60 mg/mL、12.22 mg/mL和2.67 mg/mL下降到15.73 mg/mL、7.59 mg/mL和1.40 mg/mL, 降解率分别为43.0%、37.8%和47.5%。表明DY11-1菌株对养殖有机污染物有较强的分解作用, 在改善养殖水质方面具潜在的应用价值。     

果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究

[目的]实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。     

篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的高温葡萄糖淀粉酶性质与结构

葡萄糖淀粉酶作为淀粉糖化的关键用酶之一,广泛应用于食品、医药和发酵工业等行业。由于整个制糖过程都是在高温下完成的,因此对葡萄糖淀粉酶的反应温度和热稳定性有较高要求。本研究从嗜热篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆到一个糖苷水解酶第15家族(GH15)葡萄糖淀粉酶基因(Tlga15A)并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。重组葡萄糖淀粉酶TlGA的最适pH为4.5,在75℃下表现出最高酶活。TlGA热稳定性好,65℃条件下处理1 h剩余70%以上酶活力;70℃处理30min后仍有43%酶活力。TlGA有较强的离子抗性和宽泛的底物特异性,TlGA水解可溶性淀粉、支链淀粉、糖原、糊精和普鲁兰的比活力分别为(255.6±15.3) U/mg、(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg。从葡萄糖淀粉酶TlGA的一级结构、二级结构和三级结构3个层面对其进行比较分析,发现一级结构中较少的Gly组成和三级结构中较低的非极性基团溶剂可及表面积可能是维持葡萄糖淀粉酶TlGA温度稳定性的主要原因。综合其性质特点和对结构的分析,葡萄糖淀粉酶TlGA在工业葡萄糖生产中有较大应用潜力。     

臭腹腺蝗肠道中共存的淀粉和纤维素消化酶的纯化、动力学和抑制研究（英文）

【目的】本研究旨在了解臭腹腺蝗 Zonocerus variegatus 中碳水化合物的消化。【方法】依次通过CM-Sepharose CL-6B 阳离子交换、QAE Sephadex A-50阴离子交换以及Sephadex G-100凝胶过滤,对臭腹腺蝗中肠的酶粗提取液（其中α-淀粉酶和纤维素酶的比活性分别为283±1.72 U/mg和 17±0.83 U/mg）进行了纯化。最后通过层析将共存的酶分离成α-淀粉酶和纤维素酶。【结果】这两种酶都是单体,α-淀粉酶分子量为38 kDa ,纤维素酶分子量为21 kDa。α-淀粉酶对淀粉的K_m 值为 13.8±1.29 mg/mL,V_max为3 883±52.25 U/mg pro;而纤维素酶对羧甲基纤维素底物的 K_m 值为5.03±0.57 mg/mL ,V_max为433.00±5.24 U/mg pro 。臭腹腺蝗α-淀粉酶能以不同的效率水解原淀粉,纤维素酶也能不同程度水解各种纤维材料。α-淀粉酶的水解活性在pH 6和40℃下最高,而纤维素酶的水解高活性在pH 9和45℃下最高。【结论】 从番木瓜 Carica papaya 种子中分离到蛋白类抑制剂,发现它们是这两种酶的有效抑制剂,说明这些蛋白抑制剂(CpAI和 CpCI)如果在害虫取食的作物上过量表达,则可能有利于害虫防治。尽管纤维类和淀粉类物质可能都显著提供该害虫的能量需求,但是动力学分析表明臭腹腺蝗更偏向于淀粉类食物。     

山蕗菜根酶活性的初步研究

通过蛋白质、多糖和纤维素含量的变化,研究了新鲜山蕗菜根所含内源蛋白酶、多糖水解酶和纤维素酶的活力。结果表明,新鲜山蕗菜根匀浆后1 h蛋白质水解程度为41.58%,2 h多糖水解程度约为26%,3.5 h纤维素水解程度约为3.8%。说明山蕗菜根蛋白酶和多糖水解酶具有较高活力,而纤维素酶活力较小。通过福林法和DNS法分别测得其粗提液蛋白酶和多糖水解酶的活力分别为24 221.57U/g粗酶蛋白和45 018.65U/g粗酶蛋白。     

凝结芽孢杆菌耐热β­N­乙酰氨基葡萄糖苷酶在大肠杆菌的分泌表达及其在制备GlcNAc中的应用

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶体,可作用于几丁质或壳聚糖等天然底物,从末端水解产生N-乙酰-β-D氨基葡萄糖 (GlcNAc) 单体,其在医药和农业领域有较广泛的用途。文中克隆了耐热菌凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans DMS1的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因 (BcNagZ),并成功在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 进行了分泌表达,蛋白表达量达到0.76 mg/mL。纯化后的BcNagZ分子量为61.3 kDa,测得的比活力为5.918 U/mg;进一步对该酶进行表征,结果显示酶的最适反应pH为5.5,最适反应温度为75 ℃,在65 ℃处理30 min后还有85%的残余酶活力,表明该酶具有良好的热稳定性。该酶的米氏常数Km为0.23 mmol/L,Vmax为0.043 1 mmol/(L·min)。重组BcNagZ可以水解胶体几丁质得到微量的GlcNAc,可以将二糖水解为单糖;偶联已报道的外切几丁质酶AMcase,可以有效地将胶体几丁质水解为GlcNAc,得率达到86.93%。     

产木聚糖酶白地霉培养特性及部分纯化的酶学特性

本文对白地霉Ref1的培养特性、产酶条件和酶学特性进行了初步研究。结果表明:该菌为低温型菌株,其最佳生长条件为pH6、20℃和酵母膏作为氮源;最佳产酶条件为pH3-7、15℃及以酵母膏氮源;条件优化后产酶可达118.7U/mL,可溶蛋白含量可达到60μg/mL,酶溶液的比活可达到1250U/mg蛋白质;该木聚糖酶的最适反应温度和pH分别为50℃和5,金属离子Mg2+、Na+和8mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+等对木聚糖酶的活性有抑制作用,而Ca2+、4mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+和8mmol/L的Mn2+等对该酶反应则有促进作用;该木聚糖酶在保温2h后在15-40℃范围内能保持80%以上的酶活性,在50℃时能保持68%的酶活性;用lineweaver-Burk作图法(双倒数作图法)求得该酶的最大反应速度Vmax和Km值分别为163.38mmol/mg/min和0.75mg/mL。