一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

Armillariella tabescens EJLY2098β-甘露聚糖酶的诱导、纯化及酶学性质分析

Armillariella tabescens EJLY2098经魔芋精粉诱导,可产β-甘露聚糖酶,再用正交实验优化诱导培养基,结果在培养基为魔芋精粉2％、蛋白胨1％、土豆汁25％、KH2PO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.15％、维生素B1 0.01％时可诱导出较高活性的酶。用DEAE－阴离子交换色谱从培养上清分离纯化β-甘露聚糖酶,出现2个活性组份。 活性组份P2 的SDS-PAGE分析,发现为电泳纯的一条带,分子量约78.9kD。 HPTLC分析, P2为内切β-甘露聚糖酶;酶反应的最适温度为60℃,最适pH 为4.0～6.0。保温30min的半失活温度t1/2为63℃,在pH 4.5～6.0之间稳定性较好。Na+和Ba2+对其有激活作用,等电点pI约为4.0～4.1。本研究获得了一株产β-甘露聚糖酶的新菌种,为进一步用基因工程方法克隆并构建具有完整自主知识产权的重组β-甘露聚糖酶基因工程菌提供了一个重要的基础工作。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

鲤源产β-甘露聚糖酶Bacillus velezensis HF-14109的分离鉴定及其酶学和生物学特性研究

【目的】以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌。【方法】采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价。【结果】本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强。通过形态学观察、生理生化试验、16Sr RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45°C、最适p H为6.0,在温度20–80°C、p H 4.0–9.0范围内都较为稳定;Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶具有激活作用,而Mn²⁺、Ca²⁺对该酶具有抑制作...     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性.通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91%,而种间同源性为60%69%.     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72h时重组酶活可达到1.067U/mL,蛋白含量为440mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C,在30°C～65°C比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达

目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。     

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

为了改善高密度发酵生产β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制,提高β-甘露聚糖酶产量,将VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下,进行VHb和β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因,插入表达载体p PICZαA,整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb+)与初始菌株(VHb-)对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示,限氧条件下,VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h。     

RT－PCR克隆里氏木霉甘露聚糖酶cDNA

为了省去繁杂的mRNA提取纯化过程，简便，快速，重现性好的克隆里氏木霉RutC-30β-甘露聚糖酶cDNA，本研究依据其cDNA序列设计了一对引物F1和R1，然后用总RNA直接进行RT-PCR，其产物经过EcoRI,BamHI酶切后插入P^GEM-32克隆载体，再转化到JM109感受态细胞中，克隆转化子，酶切测序。结果获得了β-甘露聚糖酶编码的成熟肽cDNA，其序列与GenBank报道完全一样，另外，对有利于用RT-PCR克隆cDNA的高诱导产生β-甘露聚糖酶的里氏木霉RutC-30菌体培养条件进行了研究。     

β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大肠杆菌中共表达

【目的】β-甘露聚糖酶和木聚糖酶都属于半纤维素酶,它们已经同时运用于工农业生产的许多领域。构建β-甘露聚糖酶和木聚糖酶共表达菌株并进行相关评价。【方法】通过设计一个共同的酶切位点,将菌株Bacillus subtilis BE-91中的β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因串联到表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌构建了一株能够共表达β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的菌株B.pET28a-man-xyl。【结果】菌株诱导21 h后,发酵液中β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别为713.34 U/mL和1455.83 U/mL,是胞内酶活的11.8倍和2.53倍。【结论】SDS-PAGE分析、水解圈活性检测和胞外酶与胞内酶酶活检测表明:两个酶均以功能蛋白独立分泌到胞外。此外,与β-甘露聚糖酶和木聚糖酶单独酶解半纤维素相比,复合酶的酶解效果更好。菌株的成功构建为复合酶制剂(半纤维素酶制剂)的研究和生产奠定基础。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究

研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质.该基因全序列2010 bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827 kD.根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotoga sp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%.重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7 U/mg蛋白.粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶.以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95℃和pH 8.0,85℃处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业.对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖.     

构巢曲霉内切甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及重组蛋白质的表征

【目的】内切甘露聚糖酶是一类重要的半纤维素酶,能够有效水解半纤维素的第二大组分甘露聚糖,已广泛应用于工业生物技术领域。【方法】本文对来源于腐生真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的一个内切甘露聚糖酶在毕赤酵母中进行过表达及详细的酶学性质研究。【结果】该甘露聚糖酶在摇瓶和发酵罐条件下都成功获得表达,发酵罐条件下的蛋白质表达量高达3.9 mg/mL;该酶的最适pH和温度分别为4.0和60°C,在pH 5.0–9.0之间表现出了很好的稳定性;在温度≤40°C时,该酶非常稳定,当温度≥60°C,该酶的稳定性大大降低;Co~(2+)和Zn~(2+)促进了该酶的活性,而Pb~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)等金属离子表现出了一定的抑制作用。【结论】该构巢曲霉来源的内切甘露聚糖酶能在毕赤酵母中高效表达,表现出了一定的耐酸、耐碱及耐热等性能,具有开发为商品酶的潜力,为深入开发构巢曲霉来源的其他糖苷酶奠定了基础。     

Coexpression of β-mannanase and xylanase genes in Escherichia coli

[目的]β-甘露聚糖酶和木聚糖酶都属于半纤维素酶,它们已经同时运用于工农业生产的许多领域.构建β-甘露聚糖酶和木聚糖酶共表达菌株并进行相关评价.[方法]通过设计一个共同的酶切位点,将菌株Bacillus subtilis BE-91中的β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因串联到表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌构建了一株能够共表达β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的菌株B.pET28a-man-xyl.[结果]菌株诱导21h后,发酵液中β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别为713.34 U/mL和1455.83 U/mL,是胞内酶活的11.8倍和2.53倍.[结论]SDS-PAGE分析、水解圈活性检测和胞外酶与胞内酶酶活检测表明:两个酶均以功能蛋白独立分泌到胞外.此外,与β-甘露聚糖酶和木聚糖酶单独酶解半纤维素相比,复合酶的酶解效果更好.菌株的成功构建为复合酶制剂(半纤维素酶制剂)的研究和生产奠定基础.     

枯草芽胞杆菌甘露聚糖酶发酵条件优化

旨在以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis J为生产菌株,发酵生产β-甘露聚糖酶,通过优化产酶条件,以达到提高β-甘露聚糖酶产量的目的。利用DNS比色法检测β-甘露聚糖酶活力,采用单因素试验,研究碳氮源种类及碳氮源浓度、温度、pH、接种量和装液量对菌株Bacillus subtilis J发酵产β-甘露聚糖酶的影响,结合响应面试验设计确定菌株Bacillus subtilis J发酵产甘露聚糖酶的最优发酵培养条件。单因素试验和响应面试验得到最优的发酵条件为魔芋粉28 g/L,胰蛋白胨21 g/L,K₂HPO₄ 6 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,温度31 ℃,pH值 8.5,接种量1%（体积分数）,装液量50 mL/250 mL,发酵周期24 h。利用优化后的培养基生产β-甘露聚糖酶,其酶活力达到84.38 U/mL,是初始发酵培养基产酶活力的3.36倍。通过对发酵条件的优化,大幅度提高了β-甘露聚糖酶的产量,为其工业生产提供数据参考。     

一株产耐高温β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定

目的:筛选鉴定一株产耐高温β-甘露聚糖酶的天然菌株。方法:通过形态、生理生化特征及16S rDNA比对,对从水温高于68℃的热泉中分离出的一株产β-甘露聚糖酶细菌进行鉴定。结果:该菌株的最适生长温度为50℃,可在35～80℃条件下生长,确定为一种极端嗜热枯草芽胞杆菌;该菌所产的β-甘露聚糖酶可耐受90℃高温处理。结论:产耐高温β-甘露聚糖酶极端嗜热枯草芽胞杆菌的筛选鉴定,为后续重组耐高温β-甘露聚糖酶的开发奠定了基础。     

枯草杆菌manA基因的克隆及定点突变

manA是编码β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC3.2.1.78)的基因。将枯草杆菌A33株的manA基因插入到pET-32a载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源非融合表达,表达活力为41.58U/mL。为了提高酶的表达活力,当采用PCR介导的定点突变技术将该基因第2号密码子CUU突变为GUU,构建成突变表达载体pET-32a-manA*并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,目标酶表达活力增加到138.65U/mL。说明当β-甘露聚糖酶N端第二号氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸后,酶在大肠杆菌中的表达活力大大提高。推测是由于突变后的β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的稳定性增强所致。突变表达的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH值并没有发生明显改变。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

诺卡氏菌形放线菌β-甘露聚糖酶的水解特性

诺卡氏菌形放线菌（Nocardioform actinomycetes）NA3-540产生的β-甘露聚糖酶（ManNA）能不同程度地水解槐豆胶、瓜胶、田菁胶和魔芋胶等甘露多聚糖为组分的植物胶,生成系列甘露寡糖;该酶只轻微地水解香豆胶,不能水解β-甘露聚糖、黄原胶、海藻胶;ManNA对槐豆胶、瓜胶和魔芋胶多糖的Km值和Vmax分别为1．75、6．13、3．9mg／mL和2485、1303、853μmol／（min／mg）,表明槐豆胶是该酶的理想水解底物。ManNA水解几种植物胶的明显差异,表明甘露聚糖的糖链组成和空间结构明显地影响着β-甘露聚糖酶的水解活性。