整合素αvβ6与肿瘤关系的研究进展

肿瘤的发生发展受到多种因素影响,因肿瘤而死亡的原因仍然是我国居民死亡的主要原因之一,对于肿瘤的防治一直是我国乃至世界医学界关注的重点。整合素(integrin, ITG)是能够介导细胞与细胞之间、细胞与基质之间相互黏附的一类细胞膜上的跨膜糖蛋白。研究证明,整合素是由αv与β6两个亚基组成的一种最具特征性、在肿瘤中表达异常的异二聚体。近年来大量的研究证明整合素αvβ6在正常和良性肿瘤上皮组织中与在多种恶性肿瘤上皮组织中表达具有明显差异,在肿瘤进展中具有重要意义。本文主要就整合素αvβ6与肿瘤的关系进行概述。     

脉络膜黑色素瘤中整合素αvβ3表达的研究

目的：整合素αvβ3整合素家族成员之一,是一类跨膜粘附分子,其在多种肿瘤细胞及新生内皮血管细胞中高表达而在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达。基于这些特征,整合素αvβ3年来成为分子影像研究的热点之一。鉴于整合素αvβ3人眼脉络膜黑色素瘤中是否存在表达尚不可知,本课题拟研究整合素αvβ3人脉络膜黑色素瘤中表达情况,为以整合素αvβ3基础的分子显像提供理论基础。方法：培养人源脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,使用蛋白免疫印迹方法检测整合素αvβ3OCM-1中表达水平,并使用免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中整合素αvβ3达分布。结果：蛋白免疫印迹实验表明在OCM-1细胞株中存在整合素αvβ3达,其表达水平介于已知高表达整合素αvβ3头颈鳞癌细胞株HEP-2和较低表达整合素αvβ3头颈鳞癌细胞株CNE-1之间,免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中也存在整合素αvβ3达。结论：人脉络膜黑色素瘤中具有整合素αvβ3达,可以为后期研究基于整合素αvβ3分子显像技术提供依据。     

脉络膜黑色素瘤中整合素α_vβ_3表达的研究

目的:整合素α_vβ_3为整合素家族成员之一,是一类跨膜粘附分子,其在多种肿瘤细胞及新生内皮血管细胞中高表达而在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达。基于这些特征,整合素α_vβ_3近年来成为分子影像研究的热点之一。鉴于整合素α_vβ_3在人眼脉络膜黑色素瘤中是否存在表达尚不可知,本课题拟研究整合素α_vβ_3在人脉络膜黑色素瘤中表达情况,为以整合素α_vβ_3为基础的分子显像提供理论基础。方法:培养人源脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,使用蛋白免疫印迹方法检测整合素α_vβ_3在OCM-1中表达水平,并使用免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中整合素α_vβ_3表达分布。结果:蛋白免疫印迹实验表明在OCM-1细胞株中存在整合素α_vβ_3表达,其表达水平介于已知高表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株HEP-2和较低表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株CNE-1之间,免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中也存在整合素α_vβ_3表达。结论:人脉络膜黑色素瘤中具有整合素α_vβ_3表达,可以为后期研究基于整合素α_vβ_3的分子显像技术提供依据。     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

骨唾液酸蛋白通过整合素αvβ3调控ILK信号通路

旨在探究骨唾液酸蛋白(BSP)是否通过整合素αvβ3对整合素连接激酶(ILK)信号通路进行调控。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞,流式细胞仪在细胞水平检测BSP不同水平的细胞株中整合素αvβ3的表达量。Western blotting检测磷酸化ILK水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力。与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞中整合素αvβ3的表达水平明显下调(61.32±1.94)%(P<0.01)。整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体(LM609)处理前的BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(39.38±1.38)%(P<0.01);LM609处理后的231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(33.78±1.51)%(P<0.01)。向乳腺癌细胞231BO-scrambled和231BO-BSP27中添加LM609,MTT试验结果显示两株乳腺癌细胞的增殖能力均有降低(P<0.05)。BSP通过整合素αvβ3对乳腺癌MDA-MB-231细胞ILK信号通路进行调控,并影响细胞增殖。     

整合素αvβ3对MDA-MB-231BO乳腺癌细胞AKT信号通路的调控

旨在探究整合素αvβ3的单克隆抗体LM609在BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中对AKT(蛋白激酶B)信号通路的影响。利用免疫细胞化学法检测BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中整合素αvβ3的表达量。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231BO细胞,Western blotting在蛋白水平检测磷酸化AKT的表达,MTT试验和细胞划痕试验分别检测细胞增殖、迁移能力的变化。结果显示,与231BO-Scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞中BSP蛋白水平明显降低,抑制率达到(59.43±1.71)%;LM609分别处理两株细胞后,与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组21BO-BSP27细胞中AKT磷酸化水平下调明显,为(33.78±1.51)%(P<0.01);231BO-BSP27细胞和对照组231BO-Scrambled中细胞的增殖和迁移能力均有不同程度的下降(P<0.05)。LM609能够抑制胞内整合素αvβ3功能的表达,进而对AKT信号通路进行调控,并影响细胞增殖和迁移的发生。     

以整合素αvβ3为靶点的RGD配体在抗肿瘤血管新生中的应用

整合素αvβ3是一种能特异性识别RGD序列的膜受体蛋白,其与含RGD（Arg-Gly-Asp）模体的蛋白质结合的特异性在肿瘤细胞的粘附、迁移、浸润及肿瘤血管新生中起重要作用.由于整合素αvβ3在多种肿瘤细胞表面高表达而在正常细胞中低表达或不表达,因此其成为肿瘤治疗的理想靶点.肿瘤新生血管为肿瘤的生长提供营养,因此近年来抑制肿瘤血管新生也成为肿瘤治疗的重要途径.有研究显示,几种RGD毒素蛋白不但以整合素αvβ3为靶点靶向结合到肿瘤部位从而具有直接抗肿瘤细胞增殖、黏附、迁移及浸润功能,而且它们还具有抗肿瘤血管新生的作用,因此RGD毒素蛋白可从上述两方面抑制肿瘤生长与转移.本文就整合素αvβ3为靶向的RGD配体结构特点及其在肿瘤治疗中的靶向治疗和抗血管新生应用及前景加以综述.     

表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白αⅡbβ3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白αⅡbβ3是血小板上的一种钙依赖性膜受体,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合.通过将含有NTA-DOGS的磷脂单分子层膜转移到50 nm厚的金膜上,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振(SPR)传感器敏感膜.设计并合成了含有6个组氨酸和RGD基团的His-tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca2+、Mn2+对该相互作用的影响进行了研究.结果表明,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面,并能够保证P1维持一个有效的定向.将Ca2+从低结合位点去除或加入Mn2+都能够增加整合素蛋白的配基结合活性.二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用,可能在整合素发挥其生理功能的过程中具有重要的意义.     

α3β1整合素在糖尿病大鼠肾脏的表达及其与足细胞减少的关系

目的动态观察1型糖尿病大鼠肾小球足细胞及粘附分子α3β1整合素表达的时相变化,探讨α3β1整合素与足细胞减少,蛋白尿发生的关系。方法以1型糖尿病大鼠为动物模型,于第2,4,6,8,12周以肾小球足细胞表面标志物肾母细胞瘤抑制基因（Wilm’Stumorl,WTl）水平检测足细胞密度变化,同时以免疫比浊法检测大鼠24h尿微量白蛋白水平,及RT—PCR法测定各组大鼠肾皮质α3β1整合素mRNA的表达水平。结果与对照组相比,糖尿病大鼠从2周起出现明显的足细胞密度减低,24h尿量和尿微量白蛋白增加,4周开始出现血尿素氮升高,8周开始出现血清肌酐升高,并且随着病程进展,足细胞密度和24h尿微量白蛋白水平变化更加明显。α3β1整合素mRNA水平从第2周起比正常对照组明显降低,而在4周、8周和12周并没有呈现持续的减少。结论在糖尿病肾病早期,α3β1整合素水平降低可能是导致足细胞减少和蛋白尿发生的主要原因,而随着糖尿病病程进展,可能有其他机制参与,从而导致了糖尿病肾病足细胞减少、蛋白尿发生和肾小球损伤的进展。     

多聚甲醛固定对流式细胞术检测HepG2细胞整合素αVβ3的影响

目的:检测HepG2细胞表面整合素αVβ3的表达情况,同时探讨多聚甲醛的固定处理对HepG2细胞表面αVβ3检测的影响。方法:分别用0.25%的胰蛋白酶和1%的EDTA消化收集HepG2细胞,以FITC标记的抗αVβ3单抗检测细胞表面αVβ3的表达情况;在检测中,用2%浓度的多聚甲醛固定细胞后,采用流式细胞仪测定多聚甲醛固定组和未固定组HepG2细胞的平均荧光强度和阳性细胞率,对结果进行统计学分析。结果:以胰蛋白酶消化HepG2细胞后,抗αVβ3单抗标记的阳性细胞率为3.6%,远低于EDTA消化组的阳性细胞率(47%)。多聚甲醛固定组的平均荧光强度为2.23,阳性细胞率为4.6%;而未固定组的平均荧光强度为6.97,阳性细胞率为30.1%。以上结果经统计学分析,均具有显著性差异(P<0.05)。结论:HepG2细胞表达整合素αVβ3,多聚甲醛固定处理可干扰对HepG2细胞αVβ3的检测。     

双靶点分子探针68Ga-RGD-BBN用于乳腺癌的microPET显像

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)和蛙皮素(bombesin,BBN)多肽分别能够特异性识别整合素αvβ3和胃泌素释放肽受体(gastrin releasing peptide receptor,GRPR).我们用谷氨酸将RGD和BBN连接制备成RGD-BBN异源二聚体多肽,用双功能连接剂NOT...     

人黑色素瘤细胞裸鼠肺转移模型的建立

目的建立整合素αvβ3高表达的黑色素瘤细胞肺转移模型。方法通过将不同数目的M21细胞经尾静脉接种裸鼠,适时处死后计数肺表面癌结节。通过实时定量PCR和明胶酶谱的方法比较肺转移灶细胞与亲代M21细胞差异。结果M21细胞1×10^6、2×10^6、5×10^6尾静脉接种裸鼠,均能形成肺转移灶,癌结节数目均值分别为：84±8、70±6、88±12,三组之间没有明显差异,阴性对照组未形成转移灶。M21肺转移灶细胞与亲代细胞相比,增殖增快,MMP-2活性增高,整合素αv和β3mRNA表达水平明显增高。结论M21细胞1×10^6经尾静脉接种裸鼠50d内即可100%成瘤。M21肺转移灶细胞具有更快的增殖能力,整合素αvβ3和MMP-2表达水平明显增高。本实验建立了稳定的肺转移模型,为黑色素瘤和整合素αvβ3的研究提供重要的动物模型。     

整合素αMβ2 I-结构域的基因合成和蛋白表达

目的：利用大肠杆菌表达系统表达整合素αMβ2 I-结构域,并对其进行纯化。方法与结果：利用DNAWorks在线引物程序设计经过密码子优化的整合素αMβ2 I-结构域的寡核苷酸序列;采用PCR介导的基因拼装法合成αMβ2 I-结构域DNA模板,将其克隆至原核表达载体pET11d-6h上,并转化大肠杆菌,获得表达菌株;经IPTG诱导,αMβ2 I-结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化后,纯度达到90％以上;电喷雾电离质谱测定表明纯化所得的蛋白精确的相对分子质量为23720.0,与预期值相符;肽指纹质谱图谱鉴定其为目的蛋白。结论：αMβ2 I-结构域的高效表达,为进一步研究其与配体的结合及其复合物晶体结构奠定了基础。     

围植入期小鼠子宫内膜中整合素β3亚基的表达

目的 研究整合素β3亚基与胚泡植人的相关关系。方法 取未孕动情期、真孕及假孕3-6天小鼠子宫作切片,用免疫组织化学和图像分析法检测整合素β3亚基围植人期子宫内膜的表达状况和变化规律。结果 整合素β3亚基仅分布于子宫内膜腺上皮的细胞膜。在真孕组小鼠,受精后第4天,整合素β3亚基含量明显上升,第5天达到高峰,第6天又突然回落;假孕组小鼠,只有第5天时呈弱阳性表达,其余各天的表达均降至检测水平之下。结论 ①整合素β3亚基在真孕小鼠子宫内膜的表达与植人窗的开放相吻合,是子宫内膜接受性的客观标志。②启动整合素β3亚基表达变化的信号不仅受母体因素调控,还与胚泡刺激有关。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

构建人整合素β3亚基全读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础.根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达.     

G蛋白与整合素αⅡbβ3的双向信号转导

整合素是一类细胞表面受体家族分子,通过双向信号转导参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的粘附以及细胞的迁移.整合素αⅡbβ3(GPⅡb-Ⅲa)特异表达于巨核/血小板系,并且是其含量最多的膜糖蛋白,介导血小板的粘附、伸展、聚集等.G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中发挥重要作用,其中较受关注的是:异源三聚体G蛋白和小G蛋白Rap1参与整合素αⅡbβ3的内向外信号转导;小G蛋白(Rho A、Rac等)和Gα13参与整合素αⅡbβ3的外向内信号转导.在蛋白质结构与功能关系的层面,本文总结了G蛋白的结构、分类、功能以及近年来G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中作用的研究进展.     

利用显性负模型研究整合素β3胞浆段RGT序列对信号转导的调控机制

该研究探讨整合素β3胞浆段RGT序列在整合素信号转导中的作用。利用IL-2R胞外段和跨膜段（Tac）与整合素β3胞浆段全长或截短序列构建Tac-β3嵌合体,即Tac-β3和Tac-β3Δ759,使其分别在表达GPIbIX、整合素αIIbβ3的CHO细胞株（IbIX/IIbIIIa-CHO细胞株）中稳定表达（即IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3、IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株）。利用竞争酶联免疫法对Tac-β3嵌合体进行定量,观察IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3、IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株在固相化纤维蛋白原上的伸展情况（代表外向内的信号转导）;Co-IP研究Tac-β3嵌合体、β3与下游信号分子Src的结合情况。结果发现：竞争酶联免疫法证实了两个细胞株的Tac-β3嵌合体表达都高于野生型β3,保证了Tac-β3嵌合体对内源性β3在结合胞内分子中的显性负效应;IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3细胞株在固相化纤维蛋白原上的黏附伸展能力受到抑制,而IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株在固相化纤维蛋白原上的黏附伸展能力并未受到明显影响。Co-IP结果显示：Tac-β3能结合内源性Src,而胞浆段RGT序列缺失的Tac-β3Δ759则不与内源性Src结合。选择性地破坏Tac-β3的Src结合能力即足以去除其对外向内信号转导的显性负效应,从而表明：整合素β3尾端RGT序列与Src的相互作用在这一信号转导通路中起决定性的作用。     

利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系

本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(Integrin αV,ITGαV)及整合素β3(Integrin β3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαV^KO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3^KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试...     

人整合素α4(CD49d)β7的纯化、检测及有关应用的讨论

使用亲和层析的方法,对人整合素α4β7进行纯化,通过ELISA检测尤其是对于免疫小鼠应答的监测,相应改变免疫策略,从讨论中获取正确的指导思路和适当的试验方法。在人整合素β7和抗体的研制方面取得了显著的进展。     

抗整合素β3胞外区噬菌体抗体库的构建及筛选

用RT-PCR的方法从人胶质瘤BT-325细胞中扩增人整合素β3胞外区,并克隆到载体pET-24a中构建表达载体.表达的人整合素β3胞外区经变性、复性和纯化后免疫BALB/c小鼠,提取脾脏总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,经重叠PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TGl,经辅助噬菌体M13KO7超感染,构建噬菌体单链抗体库.通过淘选从该抗体库中筛选特异性识别人整合素β3胞外区的噬菌体单链抗体.结果表明,成功构建了库容为2.6×106的抗人整合素β3胞外区的单链抗体库,初步筛选到了与人整合素β3胞外区特异性结合的单链抗体.