肠出血性大肠杆菌转移紧密黏附素受体的表达及其活性鉴定

目的:在原核表达基因工程茵中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转移紧密黏附素受体(Translocated Intimin Receptor,Tit)蛋白的高效表达,并对其活性进行初步鉴定.方法:采用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中调取tir基因,插入pEASY-T1 克隆栽体.克隆质粒测序鉴定后,采用Nde Ⅰ、Xho Ⅰ限制性核酸内切酶双酶切pEASY-Tl-tit质粒获得tir基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+).表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测相对分子质量,Western blotting验证抗原活性.荧光显微镜观察蛋白是否具有嵌入细胞膜的活性.结果:PCR扩增得到1686bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b(+)-tir经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以裂解上清形式表达,表达量约3mg/ml.经镍柱纯化后纯度达90%以上.重组表达的Tir具有嵌入细胞膜的生物学功能.结论:成功表达了具有生物活性的重组Tir蛋白,为Tir的功能研究奠定基础.     

肠三叶因子在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗体制备

目的:获得肠三叶因子(ITF)的原核表达产物及抗rITF抗体,为深入研究ITF的作用机制及其受体研究奠定基础。方法:常规提取人小肠组织总RNA,用RT-PCR获得ITF编码基因片段,克隆至质粒pET32a获得原核表达栽体,双酶切和测序后转化至Origami B(DE3)用IPTG诱导表达,优化条件获得最大表达产量;用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物,亲和层析纯化获得的重组蛋白rITF皮下多点注射家兔,制备多克隆抗体,并用此抗体进行大鼠肠组织免疫组化研究。结果:测序证实PCR扩增获得ITF全长基因序列与基因文库中的完全一致,将该基因片段正确插入表达载体pET32a中、优化表达条件后,重组蛋白的表达量达到50mg/L;Western blot证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性;通过Ni-NTA亲和层析、超滤离心后,得到90%纯度的蛋白;收集兔血清,纯化后获得特异性良好的ITF抗体,免疫组化染色肠组织显示ITF表达的部位定位于杯状细胞。结论:成功构建了表达载体pET32a-ITF,在大肠杆菌中表达并纯化获得纯度较高的rITF,并获得了生物活性较高的ITF抗体,ITF主要在肠道杯状细胞分泌表达。     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统效应因子与宿主细胞相互作用研究进展

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)通过其Ⅲ型分泌系统将效应因子注入到宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路从而有利于细菌的感染及定植。近年来对于EHEC Ⅲ型分泌系统效应因子与宿主细胞相互作用研究成为EHEC致病机制研究新的热点,研究表明,除了经典的效应因子外,一些新发现的效应因子在细菌的致病过程中也发挥着重要作用,有些效应因子能够抑制宿主细胞内正常的信号通路,有些效应因子还具有抑制细胞凋亡,干扰炎症信号通路和抑制吞噬的作用。这些发现揭示了EHEC效应因子具有多种功能,它们通过与宿主细胞间的相互作用,在细菌的感染过程中发挥着重要作用。     

禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测

从临床疑似大肠杆菌感染的病禽组织中分离到69株细菌(其中鹅源29株,鸡源40株);通过常规形态学、培养特性和生化特征的研究,确定为大肠杆菌。PCR检测表明,其中46株(66.7%)为F1 大肠杆菌,10株(14.5%)为F1 HPI 大肠杆菌,2株(2.9%)为HPI 大肠杆菌;通过比较还发现,F1菌毛和HPI在鹅源和鸡源大肠杆菌中以及不同脏器来源的菌株中具有相似的分子流行病学。O抗原鉴定结果表明鹅源大肠杆菌的O抗原型主要有O26、O78、O18、O117,鸡源大肠杆菌的O抗原型主要有O109、O24、O18、O139、O78。药敏试验表明,其中绝大多数菌株对先锋霉素V、呋喃妥因、庆大霉素敏感,对环丙沙星因菌株差异而不同,林可霉素、四环素、多粘菌素多不敏感。     

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7的毒力岛与毒力因子的研究进展

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠埃希菌的主要血清型,能引起人的出血性肠炎和溶血性尿路综合征。大肠杆菌O157:H7致病机制与其毒力岛编码的毒力因子有关,这些毒力岛包括染色体上的LEE岛、前噬菌体上的slt基因、大质粒上的hly、ka tP、espP、toxB、stcE基因。大肠杆菌O157:H7致病机理不是由单一毒力因子所决定,而是多种毒力因子共同作用的结果。     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

基于重组技术的低毒力高效大肠杆菌原核表达系统的改造与应用

[背景]大肠杆菌作为原核表达系统常用宿主菌株,具有培养成本低、周期短和操作性强等优势,但同时也存在着一些不足.[目的]降低大肠杆菌内毒素合成水平及毒力,同时提高其可溶性表达外源蛋白的能力.[方法]利用CRISPR-Cas技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)脂多糖生物合成途径中的lpxM,改变其毒性中心类脂A的侧链结构;在...     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

人热激因子-1突变体hHSF190/2在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及其活性研究

目的：在大肠杆菌和毕赤酵母中表达人热激因子（hHSF）-1突变体hHSF190/2,并对其活性进行研究。方法：利用分子克隆技术分别构建了hHSF190/2的原核表达质粒pET45b-hHSF190/2和真核表达质粒pPICZaA-hHSF190/2,分别转入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和毕赤酵母GS115进行诱导表达;经纯化除去杂蛋白后,采用蛋白免疫印迹、电泳迁移率变动分析和蛋白转导等方法研究表达产物的功能和活性。结果：hHSF190/2在2个系统中均得到有效表达,都具有与热激元件（HSE）结合的活性,但真核表达产物与HSE的结合能力明显高于原核表达产物;原核及真核系统表达的hHSF190/2都能激发热激蛋白（HSP）70的表达,但真核表达的hHSF190/2活性更高。结论：hHSF190/2有望成为有治疗作用的蛋白药物。     

重组人胰岛素样生长因子1的原核可溶性表达及活性鉴定

目的:原核可溶性表达人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)并进行生物活性测定。方法:PCR扩增hIGF-1核酸序列,克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,对融合蛋白DsbC-hIGF-1分别进行酶切、Western印迹和生物活性测定。结果:融合蛋白DsbC-hIGF-1在原核系统内经IPTG诱导,主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白量的30%～35%,Western印迹和MTT法测定结果证明重组DsbC-hIGF-1蛋白具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。结论:融合蛋白DsbC-hIGF在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在并具有类似天然hIGF-1的生物活性,这对进一步研究hIGF-1的结构和功能,开发相应的基因工程产品具有重要意义。     

KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化

VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分裂原,通过与内皮细胞表面特定受体结合,从而导致新生血管的形成,其中VEGFR-2(KDR/FIk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用,因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药.采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR酪氨酸激酶催化域(KDR-CD).采用RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,获得KDR-CD的编码基因,将其克隆至pET-30a载体,在E. coli BL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化,Western blotting结果显示表迭的KDR-CD蛋白自身磷酸化,重组KDR-CD蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性.     

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

猪α-干扰素的原核表达及活性测定

目的：表达并纯化出具有生物学活性的重组猪α-干扰素。方法：根据前期合成的猪α-干扰素基因序列设计引物,用PCR方法扩增出猪α-干扰素基因,并将其定向克隆入原核表达载体pET28中,酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,对表达产物通过镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化、透析法复性后,采用微量细胞病变抑制法测定重组猪α-干扰素的活性。结果：测序结果表明构建了猪α-干扰素原核表达载体pET28-poIFN-α;诱导表达后经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约21×10^3的位置出现明显的诱导蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经分析表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的36%,纯化后的目的蛋白纯度约为90%;采用微量细胞病变抑制法测定其活性约为1.67×10^6U/mg。结论：获得了纯度较高并具有较高活性的重组猪α-干扰素,为下一步研究猪α-干扰素药物价值及其生物制剂的生产、应用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶及其突变体的原核表达和活性分析

目的：研究原核表达的乙型肝炎病毒（HBV）靶向核糖核酸酶（RNase）及其突变体（点突变失去RNase活性）的活性。方法：将构建的靶向核糖核酸酶及其突变体基因克隆入原核表达载体pET32a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导融合蛋白（HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白）的表达;表达产物经包涵体纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定,将纯化的蛋白用透析方法复性;以酵母tRNA为作用底物,应用复性的蛋白进行RNase活性分析。结果：纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶及其突变体;复性的HBV靶向核糖核酸酶可以降解酵母tRNA且具有剂量依赖性,而复性后的突变的靶向核糖核酸酶体不具有RNase活性。结论：原核表达的HBV靶向核糖核酸酶具有较强的RNase活性,为探索HBV靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制的机理奠定了基础。     

Novel structural and regulatory features of rhoptry secretory kinases in Toxoplasma gondii

Serine/threonine kinases secreted from rhoptry organelles constitute important virulence factors of Toxoplasma gondii. Rhoptry kinases are highly divergent and their structures and regulatory mechanism are hitherto unknown. Here, we report the X‐ray crystal structures of two related pseudokinases named ROP2 and ROP8, which differ primarily in their substrate‐binding site. ROP kinases contain a typical bilobate kinase fold and a novel N‐terminal extension that both stabilizes the N‐lobe and provides a unique means of regulation. Although ROP2 and ROP8 were catalytically inactive, they provided a template for homology modelling of the active kinase ROP18, a major virulence determinant of T. gondii. Autophosphorylation of key residues in the N‐terminal extension resulted in ROP18 activation, which in turn phosphorylated ROP2 and ROP8. Mutagenesis and mass spectrometry experiments revealed that ROP18 was maximally activated when this phosphorylated N‐terminus relieved autoinhibition resulting from extension of aliphatic side chains into the ATP‐binding pocket. This novel means of regulation governs ROP kinases implicated in parasite virulence.     

人sTNFR1基因原核表达及体外抗肝细胞凋亡的活性研究

采用RT-PCR,从Hela细胞的mRNA中扩增人sTNFR1基因,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,转化入大肠杆菌,测序证实其序列与基因数据库中sTNFR1基因一致.经异丙基-β-D半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达,淀粉树脂亲和层析法纯化,得到融合蛋白sTNFR1-MBP.结果显示：经Western-blotting检测,sTNFR1-MBP具有免疫活性L流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用,这为今后的研究打下了基础.     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。     

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1的原核表达、纯化及活性研究

目的:原核表达并制备重组蜱kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1,检测其抗凝血及抑制蛋白酶活性。方法:构建pET32a-sumo/IsKuI-1原核表达质粒,并转入到E. coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析,在层析柱上用SUMO蛋白酶切割融合伴侣,纯化后得到重组目的多肽rIsKuI-1。用PT及aPTT法检测重组目的多肽的抗凝活性,发色底物法检测rIsKuI-1对丝氨酸蛋白酶的抑制活性。结果:用原核表达系统获得了rIsKuI-1,其无延长PT及aPTT活性,对人中性粒细胞弹性蛋白酶具有较好的抑制活性(IC50=1.83μM),且特异性强。结论:IsKuI-1是一种活性较好的人NE抑制剂。因此为进一步探讨rIsKuI-1的生物学功能及其作为新药开发应用奠定了基础。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:构建人IL-10原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:应用RT-PCR技术从ConA诱导的单核细胞中扩增出IL-10成熟肽cDNA片段,将其克隆到PGEM-T后载体测序,双酶切回收目的片段构建IL-10原核表达载体PET28a-IL10。PET28a-IL10转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后对其表达产物进行SDS-Page和Western Blot分析。结果:SDS-Page电泳显示IL-10在大肠杆菌中得到了表达,分子量为21000,Western Blot分析显示表达产物可于IL-10多抗特异反应。结论:IL-10在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。为其进一步生物学研究奠定了基础。