分子信标检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法

利用分子信标被切割后荧光信号的变化.发展了一种简便的检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法.以限制性内切酶Xsp I为例.将其识别位点嵌入具有茎环结构的分子信标探针(Molecular Beacon,MB)的环状部分,利用这种分子信标在溶液中形成的瞬时二聚体结构,实现了限制性内切酶对分子信标的切割.在优化的条件下,反应初速度与酶的浓度成正比,线性范围为0.05～50 U/mL,检测限为0.05 U/mL.通过改变分子信标环部的识别位点的序列.还可以检测其他限制性内切酶如Alu I的活性.     

高压力对限制性内切酶活性的影响

以质粒ｐＳＰＯＲＴ１为底物研究了高压力对Ⅱ型限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ反应的影响。高压力未引起两酶底物碱基特异性的改变,但二者反应活力均随压力升高而逐渐下降,ＸｂａⅠ对高压力更敏感。引起ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ限制性内切酶活性完全丧失的压力分别为２００和１８０ＭＰａ,半失活压力分别为１３０和７５ＭＰａ。     

三种鱼mtDNA的限制性内切酶分析

鱼类线粒体DNA(mtDNA)的限制性酶切图谱分析,对于探讨鱼类的起源和演化等方面均有十分重要的意义。但是目前有关鱼类mtDNA酶切图谱的研究较少,这主要是受方法学的限制。为此我们改良了一种鱼类mtDNA的提取法,对鲤科的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙鱼(Aristi-chthys nobilis)的mtDNA进行了限制性内切酶酶切分析。     

限制性内切酶及相关试题分析

简单介绍限制性内切酶，并通过相关试题分析，帮助学生更好地掌握这类酶的作用。     

DNA限制性内切酶与RFLP的研究

植物遗传进化及分类学的研究,通常以形态特征特性和数量性状为基础。尽管这些形态学特征都是遗传本质的表现,但环境因素却在遗传表现的过程中起了过大的作用。近年来,运用同工酶谱带和以生化指标为依据进行过不少研究,但仍不能克服环境的影响。当前,DNA限制性内切酶和衍生的限制性片段长度多态性(RFLP)方法,应用于遗传进化及分类学研究,在微生物中做了大量的工作。因为这种研究是直接针对遗传物质——DNA分子的,所以,更为精确和有效。     

猴脑线粒体DNA提取及限制性内切酶分析

本文用冷碱法从2只恒河猴和1只食蟹猴的脑组织中提取mtDNA,最后的得率大约为0.7μgmtDNA/g脑组织,是肝脏组织得率的1/3左右。与肝脏组织相比较,从脑组织中提取mtDNA有以下优点:1.匀浆方便。2.样品中蛋白杂质少,容易彻底抽提去除蛋白质。3.大分子RNA杂质极少,不经Sepharose-4B柱或RNawe处理,就可得到较纯的样品。加之哺乳动物脑的体积较大,哺乳动物脑组织不失为提取mtDNA的一个有用的组织来源。经16种限制性内切酶分析,并与来自同一个体肝脏组织的mtDNA比较,结果进一步证实,mtDNA无组织特异性。对12岁以上老年猴脑mtDNA的分析表明,在衰老中,动物mtDNA的序列可能没有变化,甲基化程度也无显著增高。     

鲤鱼肝组织线粒体DNA的限制性内切酶分析

用EcoRⅠI,HindⅢ,PstⅠ,BglⅡ,BamHⅠ,Xho Ⅰ, Xba Ⅰ, Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ共9种限制性内切酶酶切对鲤鱼肝组织的mtDNA进行酶解,利用Gel-Pro Analyzer算出各酶切片段长度及mtDNA大小,测出其大小约为16．61kb(1kb=1×103b),另外,对电泳条件的优化进行了探讨,并将实骚结果与以前报道的有关酶切实验结果进行了比较,表明鲤鱼mtDNA的长度及限制性酶切位点均存在地域差异．     

东北梅花鹿染色体限制性内切酶显带

采用限制性内切酶Hae Ⅲ、Hind Ⅲ分别处理梅花鹿中期染色体标本,发现HaeⅢ处理标本21h左右,显出类似G带、C带带型,第1、4、11、18、27、28、31对染色体的结构异染色质区对HaeⅢ敏感而浅染,而HindⅢ处理标本18h左右能诱导梅花鹿中期染色体显出类似G带、C带,第2、6、15、18、29、32对染色体的结构异染色质区对HindⅢ较敏感而浅染,性染色体Y对HaeⅢ敏感呈浅染,性染色体X对HindⅢ敏感呈浅染。表明东北梅花鹿12对常染色体和两条性染色体结构异染色质在这两种酶处理时表现出异质性。     

Endophytic Bacilli Producing Type II Restriction Endonucleases

Two of thirteen bacillar strains isolated from the inner tissues of cotton plants were found to produce type II restriction endonucleases. The investigation of the site specificity of these enzymes showed that they are AsuI and Eco31I isoschizomers.     

Free Radical Dna Adduct 8-Oh-Deoxyguanosine Affects Activity of Hp a II and Msp I Restriction Endonucleases

8-OH-deoxyguanosine can diminish the ability of the restriction endonucleases Hpa II and Msp I to cleave DNA. The exact position of the adduct within the recognition site appears to determine the extent of the effect.     

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧茵的TaqMan实时荧光PCR方法.特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧茵,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原茵没有交叉反应:灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%:所制作的标准曲线在2.5 × 101～2.5 × 106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血孤菌进行准确的定量分析.结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好,灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h.是快速检测副溶血弧菌的有效手段.     

限制性内切酶缓冲液诱导人和家兔染色体显带的研究

用限制性内切酶AluⅠ、缓冲液或空白处理人染色体标本,发现AluⅠ及缓冲液均能诱导出类C和G带,其中缓冲液诱导的类C带频率虽低于酶原液,但明显高于空白对照; 而G带的诱导率无明显差异。此外,用限制性内切酶H ae Ⅲ和 HinfⅠ及其缓冲液处理中国小型白兔外周血染色体标本,也诱导出了相应的类C和G带。 Abstract:C-and G-bands were induced in human chromosome by both AluI and its buffer after treating the samples with AluI,buffer and blank control.The frequence of C-band induced by buffer was lower than that by AluI(P<0.05),but much higher than that by blank control(P<0.001).There was no significant difference among the frequencies of G-band induced by AluI,buffer and blank control(P>0.05).Also HaeIII,and their buffers were capable of inducing C-and G-bands on chromosome of China small-sized domestic rabbits.     

中国人线粒体DNA的八种限制酶图及其电镜结构

尽管Anderson等人(1981)已测定了人mtDNA的全部序列,但还不能全面地反映整个人类mtDNA核苷酸序列的情况。因此,在具有代表特征的中国人mtDNA序列被测定之前,为了开展对中国人mtDNA的遗传学研究,笔者构建了中国人mtDNA的8种限制酶图。并通过电镜技术对mtDNA进行了研究,发现了一种周长为2μm的小环状DNA,推测它可能在核DNA和mtDNA之间的信息传递或衰老发生中起到某些作用。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。