实时荧光定量PCR及其在微生物生态学中的应用

定量描述微生物群落的组成,在微生物生态学的许多研究领域都是非常重要的。然而由于可培养技术的局限性,定量描述微生物群落成为比较困难的事情。最近包括PCR技术在内的分子生物学技术为人们提供了有力的工具,使对微生物群落的分布、丰度等有了进一步的了解。实时荧光定量PCR技术作为核酸定量检测技术,自从发明以来在微生物生态学研究中逐渐得到了广泛的应用。从微生物生态学角度,综述了实时荧光定量PCR技术的原理、发展、优缺点及其在微生物生态学研究中的应用与研究进展,并探讨了实时荧光定量PCR技术的发展和应用前景。     

实时荧光定量PCR技术在肠道微生物领域中的研究进展

实时荧光定量PCR技术是目前发展起来的快速、精确定量核酸的最有效的方法之一,是生物定量分析的强有力的手段。与宏基因组测序等测序技术相比,实时荧光定量PCR技术能确定出样品中菌体的具体数量,同时具有操作简便、快速高效、特异性强、高通量等特点,因此被广泛应用于肠道微生物领域中。近年来,在肠道微生物和疾病的相关研究中,采用实时荧光定量PCR技术已成为趋势。综述了近几年实时荧光定量PCR在肠道微生物多样性和饮食干预在微生物菌群的基因组成方面的研究进展。     

应用real-timePCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究

目的建立快速、准确从粪便标本中定量双歧杆菌的RT—PCR技术。方法传统培养定量法,普通PCR定量法,real—timePCR比较测量。结果（I）粪便标本前处理采取简单的离心和清洗、稀释步骤能去除粪便标本中的抑制物,实现不提取DNA直接进行PCR、real—time定量粪便中双歧杆菌。（2）本实验建立的PCR方法直接半定量粪便双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^3～10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本普通PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）;real-timePCR直接定量双歧杆菌技术在双歧杆菌值介于10^1-10^7CFU／ml时具有较好的分辨率,粪便标本RT—PCR得理论菌数与培养得菌数值之间差异无显著性（P〉0．05）。结论利用PCR、real—timePCR直接半定量和定量粪便中的双歧杆菌可行。     

实时荧光定量PCR的应用和进展

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新兴起的荧光探针的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在动植物基因工程,微生物和医学领域的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及在基因诊断领域的前景做了进一步的展望。     

Real—time TaqMan RT—PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热（CDV）N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real—time荧光定量RT—PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real—time荧光定量RT—PCR方法与常规RT—PCR以及韩国BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果：用20pmol／mL的引物浓度各luL和20pmol／mL的探针浓度0.3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1.24×3ng／uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数（CV）分别为2．3％、2．5％和4.2％;与常规RT—PCR和BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

实时荧光定量PCR技术及其在昆虫学研究中的应用

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)是一种利用荧光信号实时监测体外DNA分子PCR复制过程中每个循环的扩增产物,从而实现对DNA模板进行定量分析的技术,具有准确、快速、灵敏、特异等优点,在动植物基因工程、动植物检疫、微生物鉴定与分类、食品安全检测和医学等领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新的荧光探针的原理、类型进行了评述,并对实时荧光定量PCR技术在昆虫学研究中的应用进行了综述。     

分子生物学在空气微生物气溶胶研究中的应用进展

空气微生物气溶胶的研究方法很多,包括培养计数法、生物发光法、化学发光法、直接镜检法、免疫学方法、分子标志法、生物传感器和分子生物学方法(基因探针和PCR法)。分子生物学方法由于特异性强、操作简便、快速,尤其是最新发展的定量PCR的方法还可以实现对DNA或RNA的绝对定量分析,因此在空气微生物气溶胶的研究中有很好的发展前景。本文对应用PCR和实时定量PCR(QPCR)在空气微生物气溶胶领域的研究进行了综述,指出了传统PCR和QPCR的优缺点,着重对QPCR在空气微生物领域的应用进行了比较全面的分析,指出了应用QPCR检测空气微生物气溶胶还应解决的问题和前景。     

新书介绍

实时荧光定量PCR 本书在介绍实用荧光定量PCR技术原理基础上,集中论述该技术在各个领域中的应用,包括检测致病菌、病毒检测、检测基因突变和临床、遗传病研究、肿瘤研究、环境微生物检测、动物学研究、基因表达检测和流行病学等。     

四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 ,并可成功地用于低丰度RNA的准确定量     

黑鲷DMRT1基因cDNA的克隆、组织表达谱及在性别逆转前后性腺中的表达

利用RT—PCR和3′-RACE的方法从黑鲷精巢中克隆丁DMRT1基因cDNA的部分序列。组织特异性表达分析表明DMRT1基因只在精巢中表达,半定量RT—PCR检测显示DMRT1基因在性别逆转前、性别逆转期和性别逆转后的精巢中的表达量无显著差异,在鱼类成体的精巢中,DMRT1的表达量可能不会因精巢结构或生理状态的改变而发生改变,而始终维持一定量的表达。     

实时定量PCR技术及其应用

实时定量PCR(Real—time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ—PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围。本文综述了RQ—PCR技术的原理、RQ—PCR仪、RQ—PCR实时定量检测系统及其应用。     

荧光定量PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展

荧光定量PCR 作为一种核酸定量技术, 可在PCR 扩增时在体系中加入荧光染料或荧光基团, 实时监测荧光信号从而对PCR 扩增产物进行实时准确定量, 技术灵敏度高, 特异性强。通过对荧光定量PCR 的原理、分类、优缺点及几种定量分析方法对比进行简述, 并对其在国内外海洋环境污染监测中的广泛应用和研究进行了全面综述, 从而对荧光定量PCR 和分子标志物在海洋监测中的应用前景做进一步的展望。     

实时荧光定量PCR技术在检测复发性口腔溃疡患者口腔微生物菌群改变中的应用

目的 研究实时荧光定量PCR法在检测复发性口腔溃疡患者口腔微生物菌群改变中的应用。方法 取一般口腔溃疡患者和复发性口腔溃疡患者的唾液样本,分别使用涂片、革兰染色鉴定和实时荧光定量PCR法进行检测,比较检测方法是否存在差异。结果 复发性口腔溃疡患者口腔中革兰阴性球菌的数量要低于一般口腔溃疡患者（t=0.9841,P=0.0251）,其他类型的细菌则没有明显改变。细菌计数发现复发性口腔溃疡患者口腔链球菌、韦荣球菌、奈瑟菌明显低于一般口腔溃疡患者（t=0.997 4,P=0.004 0;t=0.976 7,P=0.036 6;t=0.998 4,P=0.002 6）。实时荧光定量PCR则进一步证实这个结果。结论 实时荧光定量PCR可应用于检测复发性口腔溃疡患者口腔中的菌群变化,为临床治疗和合理用药提供依据。     

新书介绍

<正>实时荧光定量PCR本书在介绍实用荧光定量PCR技术原理基础上。集中论述该技术在各个领域中的应用,包括检测致病菌、病毒检测、检测基因突变和临床、遗传病研究、肿瘤研究、环境微生物检测、动物学研究、基因表达检测和流行病学等。     

荧光定量PCR应用常见问题

1荧光定量PCR是什么荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ- PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的定量PCR技术。FQ—PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实现了PCR从定性到定量的飞跃。FQ—PCR仪在普通PCR仪的基础上加上了荧光探头和计算机。     

实时荧光定量PCR及其在传染性疾病检测中的应用

实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。与普通的PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。我们综述了实时荧光定量PCR技术的原理、定量方法,及其在传染性疾病检测研究中的应用。     

实时定量PCR及其在轮状病毒检测中的应用

实时定量PCR(Real-time polymerase chain reaction/quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR/qPCR)就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号对PCR进程进行实时监测。它具有特异性强、灵敏度高、定量准确和快速等优点,在生物医学领域中得到广泛的应用。对实时定量PCR技术的原理和类型,实时定量PCR技术在生物医学领域的应用,尤其在轮状病毒诊断、检测及疫苗研究中的应用及其未来前景进行了综述。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.     

利用实时定量PCR快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标的方法研究

目前冷鲜猪肉新鲜度指标检测繁琐,探索快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标新技术成为研究热点。利用国标法检测发性盐基氮(Total volatile basic n itrogen,TVB-N)含量,平板培养法和实时定量PCR技术分别检测腐败微生物数量。结果显示,冷鲜猪肉在4℃条件下,随储藏时间延长,微生物的菌落总数和TVB-N逐渐增加且呈线性相关,与猪肉品的腐败程度呈正相关;丙酮-氯仿法提取的细菌基因组条带清晰,提取效果好;基于SYBER GreenⅠ的实时定量PCR技术检测的菌落数量与平板培养测得菌落总数利用单因素方差分析结果没有显著性差异(P=0.7190),一致性较好;实时定量PCR方法缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。微生物是冷鲜猪肉新鲜度评价的重要指标,实时定量PCR可以作为一种快速高效检测冷鲜猪肉新鲜度指标的新技术。