具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选和鉴定

从土样中分离得到一株具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株ZJB-09225,经生理生化特征鉴定和18S rDNA测序后鉴定为卡里比克毕赤酵母(Pichia caribbic ZJB-09225)。研究结果发现,在最适发酵条件下培养32 h,生物量为8.8 g/L,体积酶活达7.2 U/L;P.caribbic ZJB-09225最适作用温度、最适作用pH值分别为35℃和7.5。在最适的催化条件下,P.caribbic ZJB-09225细胞催化50.0 g/L(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯3 h后,产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯得率3.4%,产物d.e.值99.5%以上。     

重组腈水解酶催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的关键手性中间体。笔者以表达来源于Brassica rapa subsp.的重组腈水解酶工程菌Br Nit为催化剂,不对称水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸。考察反应温度、p H以及不同底物浓度和金属离子对全细胞催化IBSN水解的影响。结果表明:全细胞催化的最适温度为30℃,最适p H为8. 0,最适底物浓度为180 mmol/L。在此条件下,利用10 g/L湿菌体催化水解IBSN,反应6 h转化率可达45. 1%,产物对映体过量值(e.e.值)达到97. 9%。     

黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

以黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因,重组质粒pLZS1外源片段为1.1kb,将pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5,得到了克隆子XA5-5(pLZS1).以水杨苷为底物,XA5-5(pLZS1)的酶活性大大高于E.Coli JM83(pLZS1).并且质粒在XA5-5中能相对稳定地存在.初步结果表明,所克隆的基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力,并可以在一定程度上降低XA5-5中酶与pNPG底物的亲和力,使其酶活减小.     

黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

以黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因,重组质粒pLZS1外源片段为1.1kb,将pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5,得到了克隆子XA5-5(pLZS1).以水杨苷为底物,XA5-5(pLZS1)的酶活性大大高于E.Coli JM83(pLZS1).并且质粒在XA5-5中能相对稳定地存在.初步结果表明,所克隆的基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力,并可以在一定程度上降低XA5-5中酶与pNPG底物的亲和力,使其酶活减小.     

高效简便合成斜纹夜蛾Spodoptera litura F.性信息素成分(Z,E)-9,11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯

高效简便合成高纯度斜纹叶蛾性信息素,为该虫生物防治提供技术支持。以(E)-2-戊烯-4-炔-1-醇为出发原料,制成(Z,E)构型的烯基碲试剂,然后与有机铜试剂偶联得到构型保持的(Z,E)共轭二烯,成功合成斜纹夜蛾性信息素成分(Z,E)-9,11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯(5),纯度(对映体过量值e. e.)达到99. 5%。     

碳源和氮源对5-酮基-葡萄糖酸生成的影响

氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并进一步氧化成2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和5-酮基-葡萄糖酸(5KGA),其中5KGA在催化剂的作用下能够转化为L(+)-酒石酸。为了提高5-酮基-葡萄糖酸产量,以仅生成5KGA的氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans HGI-1为出发菌株,研究不同碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、葡萄糖)和有机氮源(酵母浸粉、鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉籽饼粉)对5KGA产量的影响。500 mL摇瓶试验结果表明,当葡萄糖浓度为100 g/L时,5KGA产量最高为98.20 g/L;当有机氮源为酵母浸粉、鱼粉和玉米浆,其添加量的蛋白含量为1.60%时,5KGA产量分别为100.20 g/L、109.10 g/L和99.83 g/L,其中,使用鱼粉的5KGA产量最高,使用玉米浆的5KGA产量比酵母浸粉略低。出于经济考虑,文中选择玉米浆作有机氮源,并在5 L发酵罐中进行分批发酵放大试验,5KGA的产量为93.80 g/L,最大生成速率为3.48 g/(L·h),平均生成速率为1.56 g/(L·h)。结果表明,葡萄糖和玉米浆分别为Gluconobacter oxydans HGI-1规模化生产5KGA的最适碳源和氮源,可利用葡萄糖几乎全部(85.93%)转化为5KGA。     

(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解酶产生菌的筛选与产酶条件优化

以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源,采用手性气相法检测,筛选到一株能产对映选择性水解酶的假单胞菌Pseudomonas CGMCC No.4184.该菌产的水解酶能优先水解R型底物产生(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,产物对映体过量值达到90%以上.对菌株Pseudomonas CGMCC ...     

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中5-羟基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1-苯基-3-庚酮浓度

目的:建立快速、灵敏测定大鼠血浆中5-羟基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1-苯基-3-庚酮(DPHA)的LCMS/MS方法。方法:血浆样品经正己烷萃取后进行分析,采用Kinetex XB-C18色谱柱(2.10 mm×50 mm,2.6μm),柱温40℃,以水(含0.01%甲酸)-甲醇(含0.01%甲酸)为流动相梯度洗脱,流速0.30 m L/min,ESI离子源,多反应离子监测(MRM),用于定量分析的离子对为m/z 329.2→163.0,内标化合物益智酮甲为313.1→137.0。结果:DPHA的线性范围为1.0～2000.0 ng/mL(r=0.9996),最低定量限为1.0 ng/m L;提取回收率为73.53%～85.77%,基质效应为99.63%～110.50%;日内和日间精密度RSD均低于15%,重复性好。用该法测定静脉注射给药DPHA(1.0 mg/kg)后0.5 h大鼠血药浓度为36.2±5.1 ng/m L(n=4,RSD=14.0%)。结论:本法经方法学验证,适用于大鼠血浆中DPHA浓度的测定,适合药代动力学研究。     

柯拉斯那沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化学成分研究

为研究柯拉斯那(Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)沉香的化学成分。实验采用多种柱色谱方法从该沉香中分离得到9个2-(2-苯乙基)色酮类化合物,通过现代波谱学技术分别鉴定为6-甲氧基-2-[2-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)乙基]色酮(1)、5-羟基-6-甲氧基-2-[2-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)乙基]色酮(2)、tetrahydrochromone F(3)、6-甲氧基-2-[2-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)乙基]色酮(4)、6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮(5)、6,7-二甲氧基-2-[2-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)乙基]色酮(6)、6,7-二甲氧基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮(7)、6-羟基-2-[2-(4′-羟基苯基)乙基]色酮(8)、5-羟基-2-[2-(2′-羟基苯基)乙基]色酮(9)。化合物2、3和5～9均为首次从柯拉斯那所得沉香中分离得到。采用MTT法对单体化合物的细胞毒活性进行测试,测试结果表明,化合物1,2和4具有微弱的细胞毒活性。     

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的生理活性初探

本文报道了原白头翁素衍生物5-溴甲基-2(5n)-呋喃酮的合成和抗癌活性及其抑制农作物病原菌活性的探讨结果,表明在5～20μg/mL范围内,5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮对人肺癌A549细胞株有明显的抑制生长的作用;在50～200μg/mL范围内,其对玉米大斑病菌等的生长抑制率可达到95%以上.     

类肌肽4(5)-丙氨酰胺-5(4)-羧酸咪唑的酶促合成及表征

肌肽(β-Ala-L-His)是一种高效抗氧化剂,广泛应用于生物、化工、医药等领域。应用微水相酶促合成类肌肽,效率高价格低,且具有相似性质,开发前景广阔。本研究以L-丙氨酸和4,5-二羧酸咪唑制备类肌肽4(5)-丙氨酰胺-5(4)-羧酸咪唑,正交实验下的最佳合成条件为:四氢呋喃:pH8磷酸缓冲溶液=10:1.6(V/V),L-丙氨酸:4,5-二羧酸咪唑=1:3(m/m),α-胰凝乳蛋白酶:底物=1:200(m/m),35oC下磁力搅拌1.5h。硅胶G60薄层色谱(TLC)分离反应产物,Rf=0.81处出现新斑点;刮下该点纯化后进行紫外扫描,高效液相色谱(HPLC)和核磁共振,紫外光谱253nm处吸收明显增强,310nm处出现新吸收峰;253nm、310nm、330nm高效液相色谱保留时间均为4.0min;13C核磁共振显示8组碳原子。结合胰凝乳蛋白酶的催化机理,得出产物结构为4(5)-丙氨酰胺-5(4)-羧酸咪唑。     

动物组织中脱羟核糖-5-磷酸之合成

关於脱羟核糖化合物生物合成之工作,尚鮮见於文献,Racker於1952年对大腸桿菌中脱羟核糖-5-磷酸(DR-5-P)之合成舆分解,有较详细之报导,DR-5-P之合成乃依靠脱羟核糖-5-磷酸醛缩酶(DR-5-P醛缩酶)作用於3-磷酸甘油醛与乙醛而进行,此作用係一可逆反应。     

生物基塑料单体5-氨基戊酸的生物合成新途径

5-氨基戊酸(5-aminovalanoic acid,5AVA)可作为新型塑料尼龙5和尼龙56的前体,是合成聚酰亚胺的有前途的平台化合物。目前5-氨基戊酸的生物合成法普遍产率较低且合成过程复杂,成本高。为实现5AVA的绿色生物合成,本研究通过组合表达来自日本白腹鲭(Scomber japonicas)的L-赖氨酸α-氧化酶、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮酸脱羧酶和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的醛脱氢酶,在大肠杆菌中建立了一条以L-赖氨酸为原料,以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物生物合成5AVA的途径。在葡萄糖浓度为55 g/L,赖氨酸盐酸盐40 g/L的初始条件下,最终消耗158 g/L的葡萄糖和144 g/L的赖氨酸盐酸盐,补料分批发酵产生了57.52 g/L的5AVA,摩尔得率为0.62 mol/mol。与文献报道的以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物的5AVA生物合成途径相比,本文报道的新途径无需使用乙醇和双氧水,且5AVA产量进一步提高。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-O-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是:(1) CH_3CHO+CH_3OH+HCl -20℃→CH_3OCH(Cl)CH_3+H_2O(2) CH_3OCH(Cl)CH_3+C_5H_5N -20°→[CH_3OCH(Cl)CH_3·C_5H_5N](3) [CH_3OCH(Cl)CH_9·C_5H_5N] -120°→CH_3OCH=CH_2+C_5H_5N·HCl 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5’-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2’(3’)-O-甲氧乙基-5’-核苷二磷酸(ppN-2’(3’)-O-ME):ppA-2’(3’)-O-ME,ppG-2’(3’)-O-ME,ppC-2’(3’)-O-ME,ppU-2’(3’)-O-ME,以及ppΨ-2’(3’)-O-ME,产率一般为50～70%。     

5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷产生菌AIC-90菌种选育研究

已肌苷产生菌枯草杆菌GMI- 741(Ade - )为出发菌株 ,通过多因子诱变选育出具有非精确嘌呤缺陷型、丧失腺嘌呤脱氨酶的AICAR(5 -氨基 - 4-氨甲酰咪唑核苷 )产生菌AIC - 90 ,该菌株摇瓶发酵 72h产AICAR可达 2 0 .3g/L以上。     

植物阿魏酸-5-羟化酶生物信息学分析

阿魏酸-5-羟化酶(F5H)是木质素生物合成的关键酶之一,它依赖于细胞色素P450催化阿魏酸在5位上发生羟基化反应。采用生物信息学的方法和工具对在GenBank上注册的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)、杨树(Populus trichocarpa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、紫苜蓿(Medicago sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)等植物的阿魏酸-5-羟化酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括组成成分、氨基酸翻译后修饰、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级功能结构域等进行分析预测和推断。结果表明,植物F5H是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,存在于内质网等分泌途径中,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要结构元件,具有细胞色素P450家族特征性结构域及保守功能域。     

枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化

【目的】采用响应面法(RSM)优化枯草芽孢杆菌5 L发酵罐产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。【方法】利用Box-Behnken设计和方差分析。【结果】获得最佳发酵条件为:转速、通气量和培养基pH分别为500 r/min、1.05 vvm和5.08,发酵时间仅为22 h产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达2 294.4 U/mL。【结论】实验结果表明响应面法优化5 L发酵罐发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件合理可行。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-0-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是: 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5′-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2′(3′)-O-甲氧乙基-5′核苷二磷酸(ppN-2′(3′)-O-ME):ppA-2′(3′)-O-ME,ppG-2′(3′)-O-ME,ppC-2′(3′)-O-ME,ppU-2′(3′)-O-ME,以及ppΨ-2′(3′)-O-ME,产率一般为50～70%。     

果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点

吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为脯氨酸,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)+。为揭示果蝇P5CR的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总RNA,通过逆转录获得了cDNA,进而通过PCR获得了编码果蝇P5CR的cDNA片段;将此片段连接到pET-28a(+)载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白;通过EGS交联实验和凝胶过滤层析检测了P5CR在溶液中的聚合形式;应用分光光度法测定了果蝇P5CR的酶活性参数;采用悬滴气相扩散法筛选了P5CR的结晶条件并进行了优化。实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高;(2)果蝇P5CR在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式;(3)果蝇P5CR参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适pH为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟;(4)筛选得到了果蝇P5CR的初步结晶条件(0.2mol/L Ammonium phosphate dibasic,20%PEG3350 pH 8.0)。     

一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定

[目的]核黄素( vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要.如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素( flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖.3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一.在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5 -phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一.人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点.本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础.[方法]利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs.将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21( DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定.[结果]酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95％的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在.对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性.[结论]第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础.