橘色双冠丽鱼体色相关基因mc1r的组织表达分析

黑素皮质素受体1基因(mc1r)是动物体色形成的关键调控因子,为探讨mc1r基因在橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)体色褪黑过程中的调控作用,本研究利用cDNA末端快速克隆(RACE)技术首次获得橘色双冠丽鱼mc1r的cDNA全序列,并利用荧光定量PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中mc1r基因的表达差异。获得cDNA全长序列1 699 bp,共编码氨基酸325个,开放阅读框(ORF)为978 bp,5′非编码区(UTR)497 bp,3′非编码区(UTR)224 bp。氨基酸序列和系统发育分析表明,橘色双冠丽鱼与人(Homo sapiens)、斑马鱼(Danion rerio)、大黄鱼(Larimichthys crocea)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)相似度分别为55.1%、77.1%、90.15%和96.92%。荧光定量PCR结果表明,mc1r在橘色双冠丽鱼胚胎发育9个时期均有不同程度的表达,且随着胚胎发育表达量逐渐减少,推测在胚胎发育的早期阶段该基因的基础表达水平即可启动参与体色细胞形成的腺苷酸循环。在"黑色-灰白色-黄色"三个体色蜕变期,mc1r在尾鳍、鳞片、皮肤的表达均呈先降低再稍升高的变化趋势,均在灰白色过渡期呈现最低值,推测这与mc1r和Agouti存在竞争性结合,及mc1r、tyr、tyr1三者是否处于适当、平衡状态有关。橘色双冠丽鱼长至近成鱼期,非正常褪黑鱼(即未完全褪黑)各组织mc1r表达量均比正常褪黑鱼(完全褪黑)高,其中皮肤组织的相对表达量显著高于正常褪黑鱼(P 0.05),可见鱼体体表褪黑程度与mc1r表达量呈负相关。在成熟鱼体11个组织中mc1r均有不同程度的表达,其中,鳞片显著高于其他组织(P 0.05),说明橘色双冠丽鱼mc1r的主要表达部位是鳞片。本研究通过了解体色变异相关基因表达特征,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料。     

在不同养殖背景下鳜mc1r组织表达差异和启动子转录调控分析

为探究鳜(Siniperca chuatsi)黑素皮质素1受体基因mc1r在不同养殖背景下的组织表达差异及转录调控机制,研究以在黑白养殖背景下产生的深、浅色体表鳜为研究对象,通过实时荧光定量PCR测定mc1r基因的组织表达差异;其次以鳜基因组DNA为模板,通过PCR扩增mc1r基因5′侧翼区不同长度的缺失片段并克隆至pGL3-Basic载体,之后将重组质粒转染到HEK 293T细胞,检测双荧光素酶的相对活性并预测其存在潜在的转录因子。结果显示,黑色背景养殖所产生的深色体表鳜与野生型更为相似; RT-qPCR检测显示深色体表鳜mc1r在背部皮肤和腹部皮肤表达量最高,而浅色体表鳜脑中表达量最高;双荧光素酶活性检测发现,构建的5个缺失片段启动子活性之间存在显著差异,且-159∽-+292启动子活性最高,推测其为mc1r核心启动子区域,并且通过在线软件预测出存在MITF、SP1等转录因子。研究克隆了鳜mc1r基因启动子区域并进行了转录活性分析,并且对潜在的转录因子进行了预测,为鱼类mc1r基因分子机制表达调控及表皮颜色可控性研究提供了理论依据。     

犬MC1R基因的分子进化分析

黑素皮质素1型受体 (melanocortin 1 receptor, MC1R)基因具有调节哺乳动物细胞黑色素形成的作用, 因此被认为是影响犬毛色的重要候选基因。基于NCBI数据库上发表的犬等10个动物种MC1R的氨基酸序列和cDNA序列, 利用生物学软件和网络信息资源, 对犬等10种脊椎动物进行了分子进化分析。结果表明: (1) 基于MC1R氨基酸序列的聚类分析显示, 10个物种明显归为2类, 7个哺乳动物种为一紧密类群, 鸡与斑马鱼和河豚为一松散类群, 该聚类结果与公认的动物分类及进化关系密切吻合; (2) PAML的Branch模型预测显示, 犬、猪、猫在与牛的分化过程中MC1R受到正向选择作用(w =90.8177); Site模型预测显示, 犬MC1R的2V、25E、184N、197V、314L为正选择氨基酸位点; (3) 染色体连锁群比较分析显示, “ZFP276-MC1R-GAS8”基因连锁关系在人、黑猩猩、鸡和犬中保持一致。     

喉癌相关基因LCRG1的克隆和表达分析

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的在喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白质无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外子,基因组RT－PCR显示有40％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT－PCR显示有54．5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。把该基因命名为喉癌相关基因（laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)。这提示LCRG1可能与喉癌的发生发展相关。     

山茶CjMYB1基因的克隆及表达分析

该研究通过序列比对分析,以野生红山茶和不同花色品种山茶为材料,采用PCR方法克隆CjMYB1基因,并通过生物信息学和表达分析对其进行初步研究,为深入研究山茶CjMYB1基因在花色形成和花发育过程的调控机理奠定理论基础。结果表明：(1)成功克隆获得山茶CjMYB1基因(GenBank登录号为OL347930),其开放阅读框长为879 bp,编码292个氨基酸,相对分子质量为33.17 kD;CjMYB1基因属于R2R3-MYB转录因子,且与拟南芥MYB基因家族的第7亚组处于同一分支。(2)荧光定量PCR分析发现,山茶CjMYB1基因在野生红山茶花芽中表达量最高,在萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有较高的表达量,推测其在山茶花器官发育中发挥着重要作用;在红色山茶品种中表达量较高,而在粉色、淡黄色、白色山茶品种中表达量较低,说明CjMYB1基因可能在红色山茶品种的花色苷合成途径中起到了关键作用。(3)亚细胞定位实验表明,CjMYB1蛋白定位在细胞核。     

葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。     

甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板,通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因（BnGOLS1）启动子片段,长度为827bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明：序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件,以及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS,通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。     

夏枯草PvDXS基因的克隆和表达分析

该研究在夏枯草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术获得该基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同组织及不同外源性物质诱导下的表达量。结果表明:克隆得到的PvDXS基因开放阅读框2 181 bp,编码726个氨基酸,理论分子量为78 040.47 D,等电点为6.75,PvDXS蛋白具有Transketolase_C结构域和Transket_pyr结构域,系统进化树结果表明,PvDXS蛋白与丹参、长春花的DXS(SmDXS2、CrDXS2)亲缘关系较近,推测PvDXS属于第Ⅱ类DXS蛋白。qRT-PCR分析表明,PvDXS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA₃处理组该基因表达量升高,其他6种外源性物质处理后表达量均降低,其中CaCl₂、SNP、SA处理后该基因的表达量显著降低。PvDXS基因在不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。这为进一步研究PvDXS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

家鸽Caveolin-1基因全长cDNA的克隆、序列和组织表达分析

窖蛋白(Caveolin)是一类构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白,由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-1基因是Caveolin基因家族的成员之一。该实验采用RT-PCR与RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术成功地克隆了家鸽Caveolin-1基因的全长cDNA。该cDNA全长2605bp,包含537bp的完整编码区,编码178个氨基酸;分析发现家鸽Caveolin-1基因编码区与牛、家犬、鸡、褐家鼠等核苷酸同源性为80.1%～93.4%,氨基酸同源性高达85.4%～97.2%;半定量RT-PCR分析表明该基因在家鸽各种组织广泛表达,脂肪中表达量最高,各种肌肉中表达量次之,肝脏中表达量最低。此结果说明家鸽Caveolin-1基因可能与脂肪、肌肉中的某些代谢途径有关。     

Fatty‐Acid Profile of Total and Polar Lipids in Cultured Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Raised in Freshwater and Seawater (Croatia) Determined by Transmethylation Method

Fatty acids from total lipids and polar lipids in cultured rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) raised in seawater (SW) and freshwater (FW) were identified and quantified from the muscle samples in January, April, and July. The highest total lipid and polar lipid amounts were found in April. July contents of total lipids were low, but percent of the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) was high in SW and FW environment (particularly n‐3 PUFAs). Variety of 17 fatty acids was identified by GC‐FID after transmethylation. The predominant fatty acids in rainbow trout from SW and FW were: docosahexaenoic acid among n‐3 PUFAs, palmitic acid among saturated fatty acids (SFAs), and oleic acid among monounsaturated fatty acids (MUFAs). Appreciably higher n‐3/n‐6 ratio was found in total lipids in April (6.40, FW fish) and in polar lipids in July (18.76; SW fish). High n‐3/n‐6 ratio in total lipids and polar lipids of rainbow trout from SW and FW, besides beneficial n‐3/n‐6 ratio in the commercial fish food, could be characteristic for the local environmental conditions (Croatia).     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

Stable Expression of a Foreign Gene, Delivered by Gene Gun, in the Muscle of Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss

We report the efficient delivery of a foreign gene into muscle of rainbow trout Oncorhynchus mykiss with a gene gun. The foreign gene was a reporter gene, chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Two CAT-containing plasmids were used: pCMV-CAT, which contains cytomegalovirus immediate early promoter, and pSV2-CAT, which contains the simian virus 40 early promoter. All plasmids were introduced by particle bombardment using a gene gun. During the 90-day sampling period following bombardment, CAT was strongly and stably expressed in the muscle of all the fish bombarded with pCMV-CAT and pSV2-CAT. No CAT expression was detected in the blood samples until 90 days after introduction, when it was found in only one fish from the pCMV-CAT group and one from the pSV2-CAT group. The stable and long-term expression of plasmid DNA in muscle makes muscle an attractive target tissue for the introduction of viral DNA for the purpose of DNA vaccination. Received June 5, 1999; accepted November 2, 1999.     

香蕉BTB/POZ域基因的克隆及表达分析

利用抑制缩减杂交文库从香蕉中分离获得一个cDNA片段,结合RACE技术获得该基因的全长序列,命名为MaBTB基因,该cDNA的ORF全长1 080个碱基。通过Blastx同源性分析结果显示该基因的氨基酸序列与水稻OsBTB、苜蓿MtBTB/POZ、拟南芥AtBPM4、葡萄VvBTB、玉米ZmBTB 、松树PsBTB基因的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、85%、84%、84%、86%和87%。遗传进化树分析发现该基因与苜蓿MtBTB/POZ和拟南芥AtBPM4基因亲缘关系较近。用RT-PCR的方法研究该基因在不同胁迫处理下的表达特性,结果表明该基因在盐、乙烯和紫外线处理后其表达量逐渐增强;低温处理和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理后该基因表达量开始降低,随后逐渐升高;伤害处理后该基因的表达量没有明显变化。     

大菱鲆MC1R基因克隆与序列分析

黑素皮质素受体1(melanocortin-1-receptor,MC1R)是黑色素形成调控中的一个关键因子.MC1R通过调节色素产生的数量和类型,决定皮肤表型.本研究根据鱼类的MC1R基因保守区的核苷酸序列设计引物,利用PCR技术扩增出大菱鲆MC1R基因部分片段,纯化后进行克隆测序.经生物软件拼接后,得到大菱鲆MC1R基因编码区951 bp片段.序列分析表明:此片段与GenBank上公布的部分鱼类的MC1R基因序列同源性较高(97%～86%).本试验结果为进一步研究该基因的结构与生物学功能奠定了基础.     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

Cloning of a cDNA Coding for Active Tyrosine Hydroxylase in the Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss): Comparison with Other Hydroxylases and Enzymatic Expression

Abstract: Although catecholamines are of critical importance for neuroendocrine function in teleost fishes, there has been no tool to give access to pretranslational regulation of their synthesis enzymes. In this study, we undertook cloning of the cDNA coding for the tyrosine hydroxylase (TH) of the rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ). First, we looked for a tissue sufficiently rich in TH to make an expression library. The cDNA coding for the rainbow trout TH (rtTH) was then cloned and sequenced. The rtTH sequence encodes a protein of 489 amino acids. Several domains and amino acids required for enzyme activity, like cysteines or phosphorylation sites, are highly conserved between species. Northern blot analysis showed a single rtTH messenger RNA of 4.2 kb expressed in the anteroventral brain. The ability of rtTH to hydroxylate l -tyrosine was analyzed by transient expression of the rtTH cDNA in COS-1 cells. In vitro TH activity, using COS-1 cell extracts, demonstrated that TH activity in transfected cells was 40-fold higher than in untransfected cells. Western blot analysis revealed a single protein of ∼65 kDa in both COS-1 cells and in trout brain. This rtTH cDNA provides us with a tool for further studies on pretranslational regulation of the enzyme in salmonids.     

枣树肌动蛋白基因cDNA片段的克隆及其表达分析

根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计引物,以壶瓶枣(Ziziphus jujuba Mill.Hupingzao)刚萌发结果枝构建的cDNA文库为模板,利用PCR技术得到了一个478 bp的cDNA片段.与其它植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在70%以上,氨基酸序列的同源性在85%以上,证明它是肌动蛋白基因在枣树中的同源cDNA片段,命名为ZjAT1(Ziziphus jujuba actin1),GenBank登录号为EU251882.DNA印迹分析结果表明,ZjAT1在枣树基因组中以单拷贝的形式存在.对不同发育阶段的不同器官组织进行了RT-PCR分析,结果显示ZjAT1基因只在花和幼果中有明显表达,在毛根、幼茎、叶片、成熟茎尖、成熟茎段以及成熟果实的果肉和种仁中都没有检测到表达.     

肾综合征出血热病毒R22株核蛋白基因的克隆序列分析及其表达

为研究肾综合征出血热病毒疫苗侯选株R22核蛋白的结构与特性,应用逆转录PCR扩增了R22编码区基因,并将扩增产物克隆于pET-3a表达质粒,测得R22株S片段编码区序列为1290个核苷酸。比较分析表明与Seoul型同源性高达96．2％,而与Hantaan型同源性仅为71．0％,与用血清学分型的结果一致。将克隆的pET－R22NP转化到BL21后,IPTG诱导得到较高效的表达,产物纯化后进行Westernblot分析,结果表达的NP仅与NP蛋白特异的单克隆抗体A35和3D9反应,而与G2蛋白特异的3D8不反应。表达的产物为汉坦病毒的诊断提供了特异性抗原。