反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测北大核心CSCD

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对中国主要的丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型进行扩增。首先,收集临床采样标本,对其进行定量和定性。第二,分别根据HCV 1b和HCV 2a序列的5’非转录区(5’UTR)设计相应的RT-LAMP引物。第三,利用与非特异模板的交叉反应以评价各引物的特异性,利用内切酶酶切产物以进一步保证扩增准确。第四,利用倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素/Mn2+的可视化方法与电泳结果比较。最后,利用RT-LAMP对所有采样标本进行HCV 1b和HCV 2a两组平行反应,SPSS统计学软件对其实用性初步评价。结果显示,所设计的RT-LAMP引物特异性好,HCV 1b和HCV 2a型产物大小均与预期相同。最低可检测的模板量为100IU/mL,且可视化染色方法电泳结果相一致。统计学软件比较扩增结果表明RT-LAMP与实时荧光定量PCR之间没有统计学差异(P>0.05)。综上,RT-LAMP设备简单,操作简便,具有在基层医疗机构的应用前景。     

内蒙古呼和浩特地区丙型肝炎病毒基因型分布

为了解内蒙古呼和浩特地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型的分布特征,为本地区丙型肝炎的治疗、预防提供基础数据资料。收集呼和浩特地区2014年1月至2015年1月就诊的门诊和住院丙型肝炎患者血清采样标本149份,均为HCV抗体检测阳性且HCVRNA定量检测阳性。QIAGEN柱式病毒RNA提取法提取HCV RNA,反转录成cDNA,巢式PCR法扩增HCVNS5B区,对扩增片段进行测序,在NCBI BLAST上进行序列比对得到相似度最大的参考序列并确定基因型,用Megalign,Clustal W进行序列分析并建立同源关系树,分析呼和浩特地区HCV感染基因型的分布特征,以及基因型与宿主性别、年龄的关系。在测序成功的94份样本中,共检出6个基因型,1b型占73.40%(69/94),2a型占19.14%(18/94),3a、3b、6a型各占2.12%(2/94),6u型占1.06%(1/94)。性别资料明确的93例样本,男女基因型分布无显著差异(P0.05)。年龄资料明确的90例HCV样本,1+2型的患病年龄高于3+6型的患病年龄有统计学意义(P0.05)。得出内蒙古呼和浩特地区HCV感染的基因型1b为主,其次为2a型,但也有3型、6型等基因型的传入。HCV的基因型4型和5型未检测到。     

A组轮状病毒可视化RT-LAMP方法的建立

【目的】建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并应用于人A组轮状病毒的基因检测。【方法】针对A组轮状病毒VP6基因的6个保守区域设计4条特异性引物,在64 °C恒温条件下进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料钙黄绿素(Calcein)作为反应指示剂,以钙黄绿素的颜色变化作为结果判定标准。评价该方法的特异性和灵敏度,并同时利用RT-LAMP和RT-PCR两种方法对90份临床腹泻样本中的病毒核酸进行检测。【结果】RT-LAMP方法特异性较高,灵敏度可以达到103 copies/μL RNA分子水平,比RT-PCR高出100倍。对临床标本的检出率与RT-PCR方法相当。【结论】建立的RT-LAMP法灵敏度较高,特异性强,节省时间,结果可视化,具有野外检测和现场快速检测的潜力。     

鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的鹅副黏病毒(gallinacean paramyxovirus,GPMV)序列(AY325797),针对GPMV的F基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测GPMV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测.结果显示,建立的RT-LAMP方法对GPMV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鸭源沙门氏菌(Salmonella anatamu)、鸡马立克病毒(MDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的扩增产物电泳后均无扩增条带.建立的RT-LAMP方法对GPMV的最低检出量为9.5 fg的cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍.表明建立的RT-LAMP方法特异性强、敏感性高.对6份临床样本的检出率为100％ (6/6),与常规RT-PCR的符合率为100％.     

环介导等温扩增技术 用于检测幽门螺旋杆菌CagA基因

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)用于检测唾液和胃液中幽门螺旋杆菌CagA基因。方法收集临床阳性样本并用荧光定量PCR检测,然后根据幽门螺旋杆菌的CagA基因序列设计LAMP引物并优化反应条件。通过LAMP检测来验证引物的特异性,并通过检测稀释的模板来验证引物的灵敏性。同时加入钙黄绿素使产物显色,使CagA基因检测可视化。最后,用LAMP方法检测收集的临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 LAMP体系的特异性和灵敏性均较好,对CagA基因检测的灵敏性是10~2 IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本的检测,CagA阳性样本的LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P0.05)。结论 LAMP对CagA基因的检测具有较好的特异性和灵敏性,操作简便,在基层医院有较好的应用前景。     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立和初步应用

目的利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立一种检测犬瘟热病毒感染的新方法。方法根据GenBank中NP基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、可视化效果和应用效果进行研究。结果在60℃等温的条件下、1 h内可完成RT-LAMP扩增过程;特异性和可视效果良好;对63份临床标本进行检测,阳性检出率为71.4%（45/63）,检出率高于RT-PCR的63.5%（40/63）。结论建立的RT-LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬瘟热病毒感染提供了一种快速简便的新途径。     

逆转录-聚合酶螺旋反应检测结核分枝杆菌的应用

目的:建立并应用逆转录-聚合酶螺旋反应(RT-PSR)快速检测结核分枝杆菌(MTB)。方法:针对结核分枝杆菌16S rRNA基因设计特异性引物,通过反应条件的优化初步建立结核分枝杆菌的RT-PSR扩增方法;随后,用2株结核分枝杆菌和11株其他致病菌进行RT-PSR、RT-LAMP和荧光定量PCR法的特异性与敏感性试验;利用RT-PSR法、罗氏培养法、RT-LAMP法和荧光定量PCR法对83名结核病患者的痰液标本进行诊断对比。结果:成功建立并优化了MTB的RT-PSR检测方法,与RT-LAMP法相比,两者特异性均为100%;RT-PSR法的检测灵敏性为1 CFU/mL,为荧光定量PCR法的10倍,且检测下限可达0.1 pg/μL;临床患者痰液样本检测结果表明,与罗氏培养法相比,RT-PSR法和RT-LAMP法的阳性率分别为98.80%(P0.05)和96.39%(P0.05),差异均具有统计学意义。结论:与传统检测法相比,RT-PSR法对于诊断临床样本中的MTB具有良好的特异性和敏感性,适合基层医疗单位防治MTB的推广和应用。     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物, 用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D, 用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体, 转化宿主BL21(DE3), 用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳, Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明, VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高, 表达产物的分子量约为48 kD、68 kD, 并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性.结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48 kD、68 kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性.     

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本.方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同.结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景.     

应用PCR扩增对分枝杆菌分类鉴定及标本检测的研究

用对结核分枝杆菌特异性很强的引物 b对 2 1种分枝杆菌和 13种非分枝杆菌进行 PCR扩增 ,并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明 :受试菌种用引物 b在退火温度 6 1℃时 ,扩增的敏感性为 50 fg,且只能扩出结核分枝杆菌、胃分枝杆菌 ,且他们扩增片段的分子量也不相同。可见 ,用引物 b,必要时辅以引物a,对分枝杆菌 16 S～ 2 3S r DNA间隔区序列进行扩增 ,可以快速有效地鉴定分枝杆菌临床分离株 ,是分枝杆菌鉴定的一种新方法。     

基因工程

942090 PCR扩增DNA的直接测序[英]/Rao,V.B.1 Ahal.Biochem.一1994,216(1).一1 N14[译自 DBA,1994,13(7),94‘036553 综述内容如下: (1)DNANI序的基本方法 (a)三步法(退火、标记、延伸和链终止),及 (b)二步法(退火、延伸和链终止);(2)直接 测定PCR扩增的DNA序列所需考虑的变量(a) 夹带核苷酸的存在, (b)夹带引物, (c)DNA 模板的结构,(d)DNA模板末端及(e)DNA 模板的不均匀性(部分产物、嵌合产物、复合产物) 及总体考虑; (8)循环测序法; (4)快速循环 测序法; (5)单拷贝DNA测序; (6)用Mn。’ 提高测序条带的质量;及(7)直接测定…     

502例丙型肝炎患者病毒基因分型及与性别和年龄的关系研究

目的:探讨502例丙型肝炎患者病毒基因分型的情况,分析其与性别和年龄的关系,为丙型肝炎的防治提供参考。方法:收集贵州地区502例丙型肝炎患者的血液标本,采用PCR-荧光探针法检测丙型肝炎病毒基因型,并对检测数据进行统计学分析。结果:共检出4种基因型及5种基因亚型,主要以1b型、3b型为主,其次是6a、3a型,2a型较少。不同性别丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布比较,差异有统计学意义(x²=11.029,P=0.026),男、女性患者均以1b型、3b型为主要基因型,但男性感染者明显多于女性。各个年龄组HCV基因型分布比较,差异有统计学意义(x²=102.946,P=0.000),40-59岁组感染者最多,以1b型为主,其次是20-39岁组,以3b型为主,≥60岁组感染人数较少,以1b型为主。结论:贵州地区HCV呈现多基因型分布,1b、3b型为主要流行基因型,6a、3a型次之,其余基因型较少,不同性别、年龄的HCV基因型分布存在差异性。     

苏南地区1b型丙型肝炎病毒包膜区变异进化研究

本研究旨在了解本地区丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)基因型构成的前提下,分析1b型丙型肝炎病毒包膜2(second envelope glycoprotein E2)区的变异和种系进化,并研究其准种变异与临床肝病活动度的关系。对宜兴市人民医院收集的抗HCV抗体阳性患者166名,RT-PCR方法检测HCVRNA,HCVRNA阳性患者采用型特异性引物分型法确定病毒基因型;选择其中未经干扰素治疗的43例1b型慢性丙型肝炎患者的血清标本,扩增E2区,从中选取肝硬化患者4例,慢性非肝硬化患者6例的E2区PCR产物纯化测序,序列采用CLUSTALW与GENBANK上多株不同型别的HCV序列进行比对分析,结果采用Phylip软件构建遗传进化树;并观察E2区高变区1(HVR-1)的氨基酸(aminoacid,aa)残基序列的变异特征;采用单链构象多态性垂直电泳检测43例患者个体内HCVE2区准种的变异情况,比较不同肝病活动度患者准种变异情况。结果表明本地区HCV以1b型为主(84.3%),对E2区基因序列和氨基酸序列变异的分析显示其变异具有一定的规律性,种系进化树提示本地区HCV病毒序列与上海、湖南、日本等地的HCV株有较近的亲缘性。43例患者中ALT高于正常的丙型肝炎患者准种复杂程度明显高于ALT正常者(P<0.05)。故本地区HCV基因变异符合中国东南部的特点,基因变异与临床肝病活动度具有相关性。     

苏南地区1b型丙型肝炎病毒包膜区变异进化研究

本研究旨在了解本地区丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)基因型构成的前提下,分析1b型丙型肝炎病毒包膜2(second envelope glycoprotein E2)区的变异和种系进化,并研究其准种变异与临床肝病活动度的关系.对宜兴市人民医院收集的抗HCV抗体阳性患者166名,RT-PCR方法检测HCVRNA,HCVRNA阳性患者采用型特异性引物分型法确定病毒基因型;选择其中未经干扰素治疗的43例1b型慢性丙型肝炎患者的血清标本,扩增E2区,从中选取肝硬化患者4例,慢性非肝硬化患者6例的E2区PCR产物纯化测序,序列采用CLUSTALW与GENBANK上多株不同型别的HCV序列进行比对分析,结果采用Phylip软件构建遗传进化树;并观察E2区高变区1(HVR-1)的氨基酸(amino acid,aa)残基序列的变异特征;采用单链构象多态性垂直电泳检测43例患者个体内HCV E2区准种的变异情况,比较不同肝病活动度患者准种变异情况.结果表明本地区HCV以1b型为主(84.3%),对E2区基因序列和氨基酸序列变异的分析显示其变异具有一定的规律性,种系进化树提示本地区HCV病毒序列与上海、湖南、日本等地的HCV株有较近的亲缘性.43例患者中ALT高于正常的丙型肝炎患者准种复杂程度明显高于ALT正常者(P＜0.05).故本地区HCV基因变异符合中国东南部的特点,基因变异与临床肝病活动度具有相关性.     

间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的作用初探

目的:初步研究利用C3Spacer间隔子修饰引物对扩增产物电泳行为的影响及作用。方法:选取1个常用短串联重复序列(STR)位点,利用间隔子修饰该位点荧光标记引物,以DNA标准物质为模板进行PCR扩增,记录相应扩增产物DNA片段长度,进行修饰与长度变化的相关性分析。结果:选取STR位点D13S317,分别利用TTTTC3SpacerC3Spacer、TTTTC3Spacer、TTTT修饰R0X标记引物,相应扩增产物长度为182.67±0.05、182.19±0.11和181.6±0.19bp,未进行修饰的对照组引物扩增产物长度为177.09±0.15 bp,产物DNA片段长度随不同修饰基团的修饰发生规律性变化。结论:发现了一种修饰基团,用该基团修饰引物后,可在体外通过PCR反应改变扩增产物等位基因片段的大小,从而在不改变特异性引物信息的前提下使产物发生规律性位移,修饰基团与DNA片段大小呈内在相关性。     

多重等位基因特异性扩增—— 微流控芯片电泳法同时测定多个单核苷酸多态性位点

文章以微流控芯片电泳为检测平台, 建立了一种基于DNA适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增同时测定多个单核苷酸多态性(SNP)位点的方法。以白细胞介素1β(IL1B)基因中的7个SNP位点(794C>T、1274C>T、2143T>C、2766T>del、3298G>A、5200G>A和5277C>T)为检测对象, 通过PCR预扩增得一段含该7个待测SNP位点的长片段; 用限制性内切酶MboⅠ将其消化成短片段, 再与DNA适配器(adapter)相连; 以连接产物为模板, 在两管中分别用7条等位基因特异性引物和一条公用引物进行7重等位基因特异性扩增; 最后用微流控芯片电泳法分离等位基因特异性扩增产物, 根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。采用本法成功测定了48名健康中国人的IL1B基因上的7个SNP位点, 与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)和测序法测定结果完全一致。本法结果准确, 可用于同时测定多个SNP位点; 以微流控芯片电泳作为检测平台, 分析速度快, 样品需要量少; 借助于自制筛分凝胶和重复使用芯片, 使得SNP分析成本大大降低。