鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.近年来,由于新的IBV变异毒株不断出现,从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发,造成严重的经济损失[1].IBV的基因组为单股RNA,约27.6kb,该基因主要编码3种主要结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基.S1蛋白是IBV的主要免疫原基因,可刺激机体产生中和抗体,决定病毒的组织亲嗜性,在病毒血清学分类中起主要作用[1,2].H株是1993年在河南省分离的典型肾病变IBV毒株,我们对IBV的H株S1基因进行了RT-PCR及酶切分析,并将其PCR产物克隆入质粒载体,为进一步研究IBV的H株分子生物学特性和研制IBV基因工程疫苗打下基础.     

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒广西分离毒株抗原相关性的研究

本研究将26个传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)广西分离毒株以及参考株M41和常用疫苗株H120、Ma5和4/91共30个毒株,分别与根据这些毒株S1基因高变区Ⅰ的基因分型结果而选取的属于3个不同亚群的7个代表性分离毒株和常用疫苗株H120、Ma5和4/91制备的共10个单因子血清,在鸡胚气管环培养(TOC)上进行病毒中和试验,然后根据中和试验结果对1985～2008年间课题组所分离的26个IBV广西地方流行毒株与3个常用疫苗株H120、Ma5和4/91以及参考毒株M41的抗原相关性及其血清型进行分析。结果显示,30个试验的毒株分属7个不同的血清型,其中26个分离株有两个优势血清型(占总分离株的68%),分别是血清1型(包含13个毒株)和血清2型(包含5个毒株)。此外,我们还将分离毒株的血清分型结果与重要抗原基因(包括S1、N、M和3′UTR)的分型结果之间的关系进行了比较,发现它们之间的分型结果不尽相同。研究结果表明,近年来广西存在多个血清型IBV的流行而且不同时期流行的优势血清型不同,分离毒株之间以及分离毒株与疫苗毒株之间的抗原相关性也存在着差异。     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95/03和呼吸型毒株SD/97/01的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定,将两毒株的S1基因序列与10个参考毒株进行了比较.结果表明,JS/95/03和SD/97/01分别与M41和H120株亲缘关系最近,它们可能是疫苗毒株的变异株.JS/95/03和SD/97/01间的亲缘关系也较近,两者S1蛋白中只有24个氨基酸的差异,其中有15个位于前130个氨基酸中,第116位氨基酸可能与毒株的致病性有关.对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较,结果发现,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变.     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95 /0 3和呼吸型毒株SD/97/0 1的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定 ,将两毒株的S1基因序列与 10个参考毒株进行了比较。结果表明 ,JS/95 /0 3和SD/97/0 1分别与M41和H12 0株亲缘关系最近 ,它们可能是疫苗毒株的变异株。JS/95 /0 3和SD/97/0 1间的亲缘关系也较近 ,两者S1蛋白中只有 2 4个氨基酸的差异 ,其中有 15个位于前 130个氨基酸中 ,第 116位氨基酸可能与毒株的致病性有关。对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较 ,结果发现 ,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变     

几种鸡传染性支气管炎病毒活疫苗对中国流行毒株CK/CH/LDL/97I的保护作用评价

选择我国应用的五株鸡传染性支气管炎活疫苗毒株(JAAS、IBN、Jlin、J9和H120)和当地流行毒株(CK/CH/LDL/97 Ⅰ)作为研究对象,对其S1基因进行序列比对分析,结果表明疫苗株与流行毒株的核昔酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不超过76.4%和78.7%.S1基因的核苷酸系统发育树显示,疫苗株与流行毒株分属不同进化群,亲缘关系较远,属于不同的基因型.用这五株活疫苗进行针对强毒株CK/CH/LDL/97Ⅰ株的免疫保护实验,可见临床发病率为30%～100%;攻毒5d后每组随机扑杀10只鸡,采集器官,应用RT-PCR法检测病毒,气管样品病毒检出率为50%～90%,肾脏样品病毒检出率为10%～30%.由此可见:我国目前使用的主要活疫苗对异种IBV分离株的感染不能提供完全的保护作用.     

细胞源与鸡胚源传染性支气管炎病毒激活JAK-STAT信号通路的差异性研究

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)对鸡的呼吸道、肾脏和输卵管等器官造成严重损伤,主要引起鸡产蛋率下降和雏鸡死亡.目前通过鸡胚传代获得IBV疫苗株和流行毒株.IBV Beaudette株是目前实验室研究的经典毒株,已经适应人源和猴源细胞,可利用Vero细胞进行制备.有研究表明,IBV感染延迟干扰素的表达,并对JAK-STAT信号通路具有拮抗作用.本研究中发现,通过Vero细胞制备的IBV Beaudette株,在感染早期激活STAT1,通过鸡胚制备的IBV Beaudette,则不能有效激活STAT1.进一步研究发现,鸡胚传代的IBV QX株和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)亦不能有效刺激JAK-STAT信号通路.两种制备病毒的方式分别得到不同的试验结果,推测是由于在病毒感染条件下,Vero细胞分泌到培养液中的细胞因子所致.进一步研究揭示,病毒感染条件下,细胞分泌的因子,瞬时激活了 STAT1.本研究对于病毒的制备方式对天然免疫信号通路的影响,具有一定的参考和借鉴作用.     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒(IBV)(命名GX-YES),通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究,同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的SI基因和N基因并测定其核苷酸序列.结果表明:该病毒株有间接血凝性;致病性较强;血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4/91.同源性分析表明,SI基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5%～81.2%和50.7%～78.8%;N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7%～87.2%和89.5%～91.7%;SI基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远.SI基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合.本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株,这可能是目前免疫失败的重要因素,同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础.     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

IBV广东分离株GD05 S1基因的克隆、鉴定及其表达

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Brochitis virus,IBV)属于冠状病毒科冠状 病毒属,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.近年来,由于新的I BV变异毒株不断出现,从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发,造成严重的经济损失 [1, 2]}.IBV的基因组为单股RNA,主要编码3种主要结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M) 和 核衣壳蛋白(N),其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基.S1蛋白是IBV的主要免疫原 基因,可刺激机体产生中和抗体,决定病毒的组织亲嗜性,在病毒血清学分类中起主要作用 [1,3].     

鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白裂解与致病性的研究

冠状病毒的致病机理一直不清楚。对副粘病毒和正粘病毒的研究结果表明病毒的致病力与病毒纤突蛋白裂解程度有关,反过来纤突蛋白裂解程度是由纤突蛋白的连结多肽的氨基酸顺序决定的。本文试图从IBV致细胞病变作用,纤突蛋白裂解状态和连结多肽氨基酸顺序三个方面探讨IBV的致病机理。结果表明,IBV毒株在不同细胞培养(CK.CEF和Vero)中,从宿主细胞范围、致细胞病变作用和引起细胞融合几项指标表现了不同的致病力,但不同毒株从同一种细胞释放后其纤突蛋白的裂解程度无差异。连结多肽的氮基酸序列表明23株IBV的连结多肽均由5个氨基酸组成即二对碱性氨基酸Arg—Arg和Arg—Arg,中间由苯丙氨酸或丝氨酸联接。这些结果说明在致病机理方面,冠状病毒可能不同于副粘病毒和正粘病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBV Bcaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT—PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因。扩增产物经Bst YⅠ Hae Ⅲ和Pst Ⅰ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM—T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97．39％和97、27％。将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ—A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS—PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测．证实了表达产物的抗原特异性。     

中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995~1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株。对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异。通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象。以上结果表明我国1995~1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

禽冠状病毒组织嗜性和固有免疫应答差异研究

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)一直是危害世界养禽业的最重要的疫病之一.IBV变异频繁,导致出现多种不同致病性毒株,不同致病性IBV的出现可能与其感染后免疫系统的激活有关.对IBV组织嗜性和感染后的免疫机制的研究对疫病防控具有重要意义.本研究为了探究IBV不同毒株组织嗜性和固有免疫应答之间的关系.将不同IBV毒株接种原代细胞、鸡胚、SPF鸡,进行各器官的组织嗜性鉴定,应用荧光定量的方法测定TLR3、TLR7、MAVS、MDA5、IFN-β和IFN-γ等细胞因子在SPF鸡的不同组织器官包括气管、肾、胃、肺、脾和法氏囊中mRNA的表达差异.结果表明,除-H52为已知疫苗毒株外,AH毒株对泌尿系统致病性强,TM毒株对消化系统有致病性.感染实验后显示,在气管中,AH感染组MDA5的mRNA表达显著下调,TM组IFN-β和IFN-γ的mRNA表达显著性上调,H52组MAVS与IFN-β表达上调;在肺脏中,AH组TLR3、TLR7、IFN-β和IFN-γ显著性上调,在TM组能看到MDA5和IFN-γ表达显著升高,H52组的TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFN-γ上调;在肾中,AH组和TM组IFNβ和TLR7表达下调,H52组TLR7、MAVS、IFN-β和IFN-γ表达上调;在腺胃中,AH组TLR7、MAVS﹑MDA5、IFN-β和IFN-γ表达上调,TM株IFN-γ表达上调,H52组TLR7表达显著性下调,MAVS、IFN-β和IFN-γ表达上调;在脾脏中,AH组MAVS表达上调,TM组TLR3、TLR7和MDA5表达显著性上调.H52组TLR7和IFN-γ的表达也显著提高;在法氏囊中,AH组各因子表达无显著性差异,TM组TLR7、MDA5和IFN-y表达上调,H52组中TLR3、TLR7、MAVS、MD)A5、IFN-β和IFN-γ表达均显著上调.不同组织嗜性的IBV毒株在各组织器官中各细胞因子表达量不同,不同组织嗜性毒株在固有免疫应答上存在差异且与免疫分子表达水平有相关性.本实验为不同IBV毒株感染机制、疫苗开发、病原与细胞相互作用的研究应用奠定理论基础.     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

中国2000-2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

对2000-2004年从中国9个省市分离到的13株IBV的核蛋白基因片段进行序列测定及分析的结果表明,13株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1230bp的ORF,但存在基因突变现象.与GenBank中的42株参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,系统进化关系显示55株IBV毒株分属于9个群.第Ⅰ-Ⅲ群主要包括美国、日本、荷兰等国家以及中国的部分IBV分离株和疫苗株.其中本研究中的CK/CH/LHN/00I可能为一株分离的疫苗毒,CK/CH/LSD/03I、CK/CH/LDL/01I可能为重组毒.而中国近十年来分离的IBV毒株主要分布在第Ⅵ-Ⅷ群中,此3群内IBV毒株之间N蛋白推导氨基酸同源性为88.3%～100%,与其他各群之间同源性为62.3%～95.1%.因此,此基因型的IBV毒株可能在中国已有较长时期的存在且发生了较大程度的变异.其中第Ⅵ群中两株韩国分离株与中国IBV分离株具有较近的亲缘关系.以上结果表明,中国大多数IBV分离株在N基因进化关系上较为独立,与国外毒株相比,和韩国毒株进化关系密切.此外,中国IBV毒株基因重组现象更加普遍,尤其是疫苗毒和野毒之间的重组.     

中国2000—2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

对2000-2004年从中国9个省市分离到的13株IBV的核蛋白基因片段进行序列测定及分析的结果表明,13株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1230bp的ORF,但存在基因突变现象。与GenBank中的42株参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,系统进化关系显示55株IBV毒株分属于9个群。第Ⅰ-Ⅲ群主要包括美国、日本、荷兰等国家以及中国的部分IBV分离株和疫苗株。其中本研究中的CK/CH/LHN/00I可能为一株分离的疫苗毒,CK/CH/LSD/03I、CK/CH/LDL/01I可能为重组毒。而中国近十年来分离的IBV毒株主要分布在第Ⅵ-Ⅷ群中,此3群内IBV毒株之间N蛋白推导氨基酸同源性为88.3%～100%,与其他各群之间同源性为62.3%～95.1%。因此,此基因型的IBV毒株可能在中国已有较长时期的存在且发生了较大程度的变异。其中第Ⅵ群中两株韩国分离株与中国IBV分离株具有较近的亲缘关系。以上结果表明,中国大多数IBV分离株在N基因进化关系上较为独立,与国外毒株相比,和韩国毒株进化关系密切。此外,中国IBV毒株基因重组现象更加普遍,尤其是疫苗毒和野毒之间的重组。     

蓝舌病毒野毒株及疫苗株S10基因多态性分析研究

对中国蓝舌病毒1株疫苗株、31株野毒株及1株南非毒株进行测序。结果揭示33株毒株S10基因核苷酸长度均为822bp,S10基因为基因内基因,其核苷酸链的第20～22和59～61位有两个起始密码子,共有终止子在707～709位,预测编码NS3和NS3A两种蛋白;32株中国毒株间核苷酸差异0～107个,同源性86%～100%; NS3蛋白氨基酸差异0～10个,同源性956%～100%。测序毒株与GenBank中9株其它毒株比较,建立的S10基因系统发生树,将蓝舌病毒分为China group和US group两大基因群,两大群的同源性为85%;US group包括美国8株及南非1株毒株;China group包括中国32株及澳大利亚1株毒株;说明蓝舌病毒S10基因分群与毒株的地理区域来源有关。在国内首次进行了全国较大范围内蓝舌病毒分子流行病学调查,揭示了我国蓝舌病毒毒株的遗传多样性。