多聚酶链反应——方法和仪器

<正>多聚酶链反应(PCR)类似体内DNA复制过程,在待扩增的“靶”或“模板”DNA双链分子的的两端各接一个引物,经一次循环后,可得到两个相同的双链靶DNA分子。DNA分子数随循环次数呈几何级数增长,30次循环后,靶DNA被放大2~(30)倍,其拷贝数可达10~9以上,在100ul PCB反应混合物中约产生2～3μ DNA。扩增的靶DNA分子长达10～18kb,但4kb抗更短的靶DNA最适宜PCR扩增,PCR能测出10~6基因组中的一个DNA拷贝。     

利用聚合酶链反应扩增基因片段

聚合酶链反应(PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的核酸扩增法,具有敏感特异、产率高、操作简单、容易自动化等特点。由于它有成指数倍(2~n)扩增靶序列的能力,又被称之为“无细胞分子克隆”或“试管内分子克隆”。我们以化学合成的寡核苷酸的粗提物为引物,含目的基因片段的重组质粒DNA为模板,利用PCR技术成功地扩增出数百至3544bp的特异性     

多药抗药基因Mdrl探针的克隆及初步应用

多药抗药基因Mdrl的表达水平与细胞的耐药性直接相关,检测Mdrl的表达水平可预测化疗的效果以及预后,用分子原位杂交的方法可检测单个细胞中Mdrl的表达水平.用PCR扩增方法获得了一段特异的DNA片段,并将其克隆到pUC18载体中,经DNA序列分析证明与文献报道一致,此探针可用于临床标本的分子杂交检测.     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

纳米生物条形码技术在分子诊断中的应用

纳米生物条形码技术是一种新型的分子诊断技术,在核酸和蛋白质检测领域已经分别达到和超过现今的检测灵敏度.该技术采用纳米颗粒修饰的核酸或抗体对靶分子进行识别,并利用磁场将其分离,操作简单,不依赖酶反应,具有广泛的应用前景.该技术在病毒DNA、癌症的指标蛋白质等方面的应用已有文献报道,并有望成为一种常规的分子诊断工具.     

定量PCR和逆转录PCR在病毒学的应用

<正>在过去几年内,分子杂交法由于其技术多样性和高度特异性已被广泛用于基础和应用病毒学中。采用这些技术,可以在分子水平上直接进行临床样品的DNA和RNA病毒的检测、病毒基因体外-体内特异性转录活性的分析、以及病毒-宿主相互关系的研究。然而,尽管这些方法对多种检测是很有效的,但只有PCR扩增技术的发展和最佳化才明显提     

DNA足纹步移作图法

一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是：采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物（正向或反向）进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧－1190～－273区域的DNA足纹部分作图.     

基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印检测法

建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先,用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针 (T10,T40),其中检测探针与靶DNA 5￠端互补,两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时,芯片表面捕捉探针P1 (与靶DNA分子3￠端互补) 通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子,将其固定于芯片上,同时检测探针通过与靶DNA 5￠端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面,结果在芯片表面形成“三明治”结构,后通过链霉亲和素-生物素反应,使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶,最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10,T10和T40摩尔比为9:1时可以检测1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物,检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高,操作方法简单、快速,不需要特殊仪器设备,在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。     

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。     

聚合酶链反应

PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑.     

DNA环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用

DNA环介导的恒温扩增(LAMP)反应,是分子生物学领域中的一个新概念,它可以在恒温(60～65℃)条件下,30～60 min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到109水平。该方法的一大特色是,可以通过反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。因此,对于病原微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。LAMP方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断,以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。表明,该方法已具有成功应用的现实性,为快速基因检测提供了一种新的技术途径;比PCR方法更具推广性,可望作为常规检测工具。     

单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增,因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并直接作为模板进行PCR扩增,结果表明:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为95%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为65%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测,结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法,在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行,检测结果真实可靠。     

一种新的DNA 片段扩增法— 聚合酶链式反应法

随着分子生物学的发展,对特定核若酸片段进行 分离、纯化及扩增已成为基因分子生物学研究的中心 问题。自从197,年Southern转移技术建立以来,这 一领域已经取得很大进展。但已建立的方法在特异性 和灵敏度等方面尚未达到令人满意的水平：同时操作 复杂,这已成为提高研究速度的主要限制因素。用常 规方法对特定DNA片段进行分离,提纯和扩增,不仅 费时费力,并且对微量样品中的单拷贝片段的分离和 扩增尤其显得困难。由Mullis等％L23建立的聚合酶 链式反应法（polymerase chain reaction,简称PCR）有 效地解决了这一问题。运用PCR技术可以使1微微 克样品DNA中存在的仅有一个拷贝的特定核营酸片 段得到大量扩增。与常规方法相比,运用PCR技术 可大大地缩短操作时间及减小劳动强度,因为不再需 要次级克隆及分离、纯化等繁杂的步骤,而只要合成两 个起始引物,将基因组DNA与这两个引物及DNA聚 合酶等所组成的反应体系在三个不同温度的水浴中机 械地操作之后,就可得到两个引物5‘末端之间的大量 的DNA片段。并且不需要进一步纯化,其纯度就足 以满足有关核昔酸片段的分析研究。现在国外一些公 司已推出一种装置,可使PCR反应完全自动地进行。 从PCR技术的出现（Mullis"], Saikit'23, Saikiti41）到 现在只一年多的时间,但这技术已广泛地应用于分子 生物学研究的各个方面。可以预期,PCR技术将极 大地促进基因分子生物学的研究。     

SNP与基因检测及表达中的RCA技术

滚环扩增(rollingcircleamplification,RCA)技术是一种新的分子生物学检测方法。该方法不仅可以在体外等温条件下对核酸进行高度特异性的检测,而且还可通过线性或指数扩增来进行信号级联放大,其灵敏度能达到1个拷贝的核酸分子,因此,可用于痕量分子的检测。目前,滚环扩增技术广泛应用于全基因组DNA检测、核酸测序、单核苷酸多态性、DNA芯片及蛋白质芯片分析等领域。     

基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展

数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术．该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数．DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素．本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景．     

蛋白质检测新技术——邻位连接技术及初步应用

邻位连接技术（proximity ligation assay,PLA）,是新研发的一项高灵敏度的蛋白质体外分析技术。该方法利用一对邻位探针（proximity probes）对靶分子进行双识别,通过连接反应产生可扩增的检测信号,以实时 PCR进行放大和检测,将对蛋白质的检测转变成为对DNA的检测,实现痕量蛋白的分析,具有极高的检测灵敏度和特异性。综述了邻位连接技术的原理、研究进展以及该技术在蛋白质分析及疾病诊断领域的初步应用。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

单根毛发具有不同的DNA分型

在DNA水平上研究遗传变异性已在基因定位和疾病诊断方面取得明显进展,并应用于法医学领域。用限制性片段长度多态性(RFLP)分析DNA时,多个位点分型需要微克量的DNA,单个位点则需数百毫微克量的DNA。象单根毛发和血斑等法医样品往往不能获得上述量的DNA。既然单个DNA分子的某一特定基因片段也能用聚合酶链反应(PCR)大量扩增,为了检测人单根毛发中的多态性DNA顺序,实验以PCR扩增毛发DNA,然后进行DNA分型。     

滚环扩增技术的原理及其应用的研究

滚环扩增是近年来发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此,RCA技术在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等方面检测中具有很大的应用价值和潜力。     

多聚酶链反应在细菌学方面的应用

<正>多聚酶链反应(PCR)是一种新兴的体外DNA扩增技术,自Saiki报告以来,PCR已广泛应用于各研究领域。木文就近年来PCR在细菌学方面的检测情况作一综合。 一、PCR的基本原理 PCR是一种高度敏感和特异的体外DNA扩增法,具有简便、快速等优点。其基本原理是,以人工合成的两个具有特定序列的脱氧核苷酸片段作为引物,分别与目的基因片段DNA双链的3’端互补。