II类内含子的研究进展

自1977年以来,发现绝大多数真核生物的基因都是不连续的,即在编码序列中间有一个或数个间插序列(intervening sequence,IVS),前者被称为外显子(exon),后者被称为内含子(intron)。在DNA转录时,外显子和内含子的全部序列都被转录,形成前体mRNA。然后经过转录后加工,引入5′端帽子结构,3′端加上一段多聚腺苷酸。再经过剪接,去除不翻译的间插序列,把翻译部分连成一条链,形成成熟的mRNA。而原核生物的基因转录成mRNA,随即翻译成蛋白质,基因是连续的,在转录和翻译的过程中不需要剪接。     

可动性I型内含子

真核生物绝大多数基因初始转录物的后加工过程涉及内含子(intron,亦称间插序列IVS)的切除和外显子(exon)的连接。自从Kruger和Cech等人首次发现嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)大亚基rRNA的间插序列能够催化自身切除和外显子连接以来,自我剪接内含子(self splicing intron)及其他有催化功能的RNA的例子在不断增多.RNA催化功能的发现强     

家兔UCP2基因多态性的筛选和生物信息学研究

本文研究兔的UCP2基因的多态性,为地方兔种的选种和选育提供一定的依据。分别以比利时兔、加利福尼亚兔和新西兰兔构建其DNA池,设计6对引物扩增3个兔种UCP2基因的外显子序列和部分内含子序列,用PCR产物直接进行双向测序快速的筛选出兔的UCP2的多态位点。结果表明:在兔UCP2基因中筛选到8个多态性位点:intron2-G2217T、exon3-A63C、exon3-G169A、intron5-C61A、exon6-C11G、intron6-C7T、intron6-C46T、intron6-C73A,其中exon3-A63C和exon3-G169A位于第3外显子上,且exon3-A63C为错义突变,导致编码的酪氨酸(Tyr)变为丝氨酸(Ser)。exon6-C11G在第6外显子上,其余的多态位点都在内含子中,除了intron6-C7T外,其余的多态位点在三种兔种中都有。结论:通过生物信息学对兔UCP2基因的分析发现m RNA二级结构、二级结构和蛋白质的三级结构在突变前后都发生变化。     

威宁绵羊和贵州半细毛羊STAT5b基因部分外显子SNP研究

为给贵州本地绵羊选种选育提供更好的科学依据,本试验利用威宁绵羊和贵州半细毛羊构建DNA池,设计4对引物扩增其STAT5b基因部分外显子及内含子序列。PCR产物经纯化后进行双向测序。利用DNAStar和BLAST分析确定多态性位点。利用生物信息学软件分析SNPs位点对STAT5b基因RNA二级结构、STAT5b蛋白二级及三级结构的影响。结果表明,在扩增的STAT5b基因中筛选到6个SNPs:exon5-G12A、exon8-G56A、exon8-C104T、intron2-A3164C、intron4-C1026T和intron5-T3323C,其中exon8-G56A为错义突变,导致编码的谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys);exon5-G12A和exon8-C104T多态位点均未改变氨基酸的编码,为同义突变;intron2-A3164C、intron4-C1026T和intron5-T3323C均在内含子区,不参与氨基酸编码。     

断裂蛋白质内含子的剪接机制、起源和进化

蛋白质内含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白质. 翻译后,通过蛋白质剪接从蛋白质前体中去掉,并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)形成成熟蛋白质. 断裂蛋白质内含子(split intein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂,形成N端片段和C端片段,分别由基因组上相距较远的两个基因编码. 现在已知,它仅分布于蓝细菌和古细菌中. 断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段通过非共价键(如静电作用)相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接. 断裂蛋白质内含子的发现进一步深化了人们对基因表达和蛋白质翻译后成熟过程复杂性的认识,而且它在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用. 本文试图综述断裂蛋白质内含子的分布、结构特征和剪接机制,并分析其可能的起源和进化途径.     

RNA 的拼接

RNA的拼接（(splicing）作用是指一种新 的RNA加工过程。自从1977年以来,几个实 验室同时报道了一些病毒和真核细胞基因的编 码序列是被非编码序列间隔开的。就是说,在 真核细胞中存在着割裂基因（(splite gene).这 样一个真核细胞基因割裂现象曾经引起了极大 的震动。编码序列叫做外显子（exon),作为其 间隔的非编码区叫做内含子（intron)。整个 DNA,包括外显子和内含子全部被转录为RNA 序列片段。这段RNA经过剪接,除去内含子 区, 将几段外显子区拼接为一个完整的RNA 的过程叫做RNA的拼接过程。如血红蛋白, 它的夕链基因就是一个由两段内含子插人外显 子之间构成的‘ii0 内含子又被称作基因的插人 序列(intervening sequence)。也就是说,成熟 的RNA序列是从相应于分割开的DNA序列 的片段装配起来的。所以,RNA拼接过程就 是割裂基因表达时RNA序列的重组过程。 在真核细胞中这种基因割裂现象是非常普 遍的。无论是细胞核、线粒体或是叶绿体的基 因中都存在割裂基因。这些基因中既有编码结 构蛋白质的,也有编码调节蛋白的。插人序列 的数目也不等。从一个基因完全没有插人序列 到一个基因被割裂50次以上。内含子的大小 范围也很不一样,可以从10个碱基对（例如在 t RNA基因中）到几万个碱基对（例如果蝇中的 homeotic基因）fai0真核细胞百分之九十以上的 非编码区中插人序列的部位千变万化。许多迹 象表明这些部位对基因表达的调节有着重要的 作用。所以研究真核细胞RNA的拼接对于了 解真核细胞基因表达的调控规律是很重要的。 RNA的拼接与生物的分化过程和发育过程都 有着极为密切的关系,它是当前分子生物学中 研究得最为活跃的课题之一。 下面我们将分两部分来介绍RNA的拼接 作用。     

HPCL2基因表达的选择性剪切分析

2-羟基植烷酸辅酶A裂解酶（2-hydroxypanthyl-CoA lyase,HPCL2）是3-甲基脂肪酸α-氧化途径中的关键酶.采用鸟枪法测序技术,得到了HPCL2基因的基因组序列.结果显示,HPCL2基因组大小为40 829 bp,共有17个外显子,16个内含子.外显子平均大小为116 bp,内含子平均大小为2 429 bp,属于结构紧凑基因.从dbEST数据库中筛选与HPCL2基因的mRNA (GenBank Acc.:AJ131753) 相互重叠表达序列标签(EST)共有213个,分别来自29个不同的组织.将EST与基因组序列进行Blast分析,共检测17个EST具有选择性剪切,其中14例属外显子遗漏（exon skipping）,2例外显子增加 (exon inclusion)和1例剪切位点改变(splicing site shift).外显子遗漏主要发生在5′端的第3到第8个外显子.结果表明,外显子遗漏可能是HPCL2基因选择性剪切的主要形式.     

贵州白山羊LEPR基因多态性

为探究LEPR基因多态性的遗传特性,本研究以贵州白山羊为试验材料,运用DNA池结合直接测序方法进行LEPR基因的SNPs位点的筛选,继而对LEPR基因RNA的二级结构以及其所编码蛋白质的二级结构和三级结构进行生物信息分析。结果表明,在试验群体LEPR基因中共发现4个SNPs,分别为exon4-G246A(Asp-Asn)、exon8-C39T(同义突变)、intron8-G59A(内含子突变)和exon18-C94T(Ser-Leu)。经生物信息学软件分析表明,exon4-G246A(Asp-Asn)和exon18-C94T(Ser-Leu)位点突变前后的等位基因频率、LEPR m RNA的二级结构、LEPR蛋白质二级结构和三级结构均有改变。     

人X染色体长臂(Xq)和短臂(Xp)基因组学比较分析

X染色体发生X染色体失活 ,但是Xp基因有 30 %表现为逃逸 ,而Xq仅不到 3%。为了研究X染色体基因失活和表达逃逸发生和维持的分子机制 ,比较了Xq和XpDNA序列的RNA模拟结合强度。X染色体的核苷酸序列被分为 5 0kb一段 ,对每一段DNA做 7碱基 (7nt)字符串组合分析 (共有 4 7=16 384种组合 ) ,记录每段 5 0kbDNA中每种 7nt字符串的频率。选择生发中心B细胞中的 12 0个高表达基因 ,计算这些基因的内含子 7nt字符串的出现频率 ,称为intron 7nt,以此作为RNAs(RNA群 ,模拟细胞中RNA在小片段的总和 )。已知一段DNA序列的 7nt频率值和intron 7nt,即可以计算该DNA段与intron 7nt的结合强度。每段 5 0kbDNA与intron 7nt的结合强度取决于该DNA段与intron 7nt互补核苷酸的频率 ,互补的核苷酸序列越多 ,结合强度就越大。DNA段与intron 7nt的模拟结合强度称为RNA结合强度 ,试图模拟该段DNA可以结合的RNA小片段的总量。之所以采用 7nt字符串组合分析是考虑到连续 7个核苷酸互补则可以形成相对稳定的结合。研究发现 :1)Xp各DNA段的RNA结合强度均值显著大于Xq (P <0 0 0 1) ;2 )Xp上高结合RNA的DNA段数目显著高于Xq (P <0 0 0 1) ;3)RNA高结合DNA段形成的簇与X染色体基因表达逃逸区关联。有证据表明 ,RNA可以通过改变染色质     

kitl非编码区突变导致RNA剪切异常的小鼠

本文主要采用RT-RCR技术从kitl1-bao纯合子和正常C57BL/6(B6)小鼠总RNA中扩增出kitl基因片段,测序后与GenBank(登录号:NM.013598)序列比对,找到mRNA上突变部位。PCR扩增kitl基因组DNA上对应部位进一步测序验证。结果发现kitl1-bao突变纯合子kitl基因mRNA缺少第8号外显子。在基因组DNA上kitl基因第8号内含子第2个碱基由T转换为C,是引起mRNA剪接错误的原因     

江口萝卜猪FABPs主要家族基因SNPs筛选及生物信息学分析

以江口萝卜猪为试验材料构建DNA池,采用直接测序技术对猪L-FABP、I-FABP、H-FABP、A-FABP基因进行SNPs快速筛查,共检测出7个SNPs,分别为intron1-T1745C、exon2-T125C、exon2-A131C、exon2-C153A、exon2-A65T、exon2-G40A、intron3-C65T。其中intron1-T1745C、intron3-C65T位于内含子上;exon2-T125C、exon2-C153A为同义突变;exon2-A131C、exon2-A65T、exon2-G40A为错义突变,分别使编码氨基酸发生Glu→Ala、Lys→Met、Glu→Lys的改变,对其进行生物信息学分析表明,突变前后的等位基因频率估算,mR NA二级结构预测,蛋白质二级、三级结构预测分析均有差异。     

稀有的黑檀体基因(ebony)5'UTR自发突变导致黑腹果蝇的黑条体突变

由于果蝇Drosophila群体中有很多自发突变其中包括多种体色突变,因此它是一个研究自发突变的优秀的模式体系。本研究证实我们实验室发现的一个可以引起果蝇体色突变的自发突变(bsr)是一个黑檀体(e)的等位基因,将其命名为ebsr。序列分析显示ebsr的5′端缺失了953个碱基,其中包括外显子1后端的206个碱基及相连的内含子1的747个碱基。逆转录PCR结果显示5′端的缺失导致内含子1不能从mRNA中剪接掉,由此导致该mRNA的翻译起始密码子AUG前端增加了一个3.2kb的序列。该序列导致ebsr的mRNA的5′UTR(5′-untranslated region)区较野生型基因增加近3kb的长度。通过mRNA二级结构分析发现这个增加的3kb的片段可以形成复杂的颈环结构(stem-loop)。免疫印迹结果显示该突变基因没有基因产物产生。本研究进一步证实了由于mRNA的5′UTR序列结构的改变可以影响到蛋白质的翻译。     

大鼠Mocs2基因跳跃型外显子可变剪接保留率的检测

可变剪接是真核生物基因表达调控的一种重要方式,它通过剪接位点调控ORFs (Open reading frames)区域外显子或内含子的表达,产生不同的mRNA剪接体,进一步翻译成具有相同或不同功能的蛋白质,从而对诸如发育、疾病、环境响应等生物学过程产生重要影响.已有文献报道,人类Mocs2基因exon 1a与exon 1b外显子发生互斥型可变剪接,产生的两个剪接体分别编码钼喋呤合酶的大小亚基,参与钼辅因子生物的合成过程.基于本课题组前期大鼠肺部组织RNA-seq测序的结果,发现Mocs2基因2号外显子转录后可被剪接或保留,产生两个不同的剪接体.为验证测序结果的准确性,本研究利用半定量PCR与实时荧光定量PCR两种方法检测大鼠脑、海马、肺组织中Mocs2基因2号外显子的保留率.半定量PCR方法检测大鼠肺、海马、大脑组织中Mocs2基因的保留率分别为(88.28±3.09)％、(99.44±0.24)％、(99.54±0.19)％.实时荧光定量PCR检测的保留率分别为(66.76±20.47)％、(75.60±12.44)％、(87.28±16.4)％.实验结果表明,Mocs2基因2号外显子在大鼠中存在可变剪接现象,且不同组织具有一定差异.本工作进一步验证了两种PCR方法检测前体mRNA可变剪接保留率的可行性.     

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

真核生物mRNA二级结构与内含子剪接

对68个外显子-内含子-外显子序列片段以及相应的外显子-外显子序列片段的二级结构进行分析后发现,内含子5′端和3′端的碱基G(剪接位点)中大约90％位于二级结构的环区或是茎区的端部并靠近环,而且位于环区的G也多靠近环的基部;92％的外显子拼接位点也有类似性质. 约82％的分枝点A位于环区或环与茎的连接部位. 折叠结构的形成使剪接位点和分枝点在空间上彼此靠近.     

mRNA选择性剪接的分子机制

真核细胞mRNA前体经过剪接成为成熟的mRNA,而mRNA前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度,剪接位点的识别可以以跨越内含子的机制(内含子限定)或跨越外显子的机制(外显子限定)进行。选择性剪接有多种剪接形式：选择不同的剪接位点,选择不同的剪接末端,外显子的不同组合及内含子的剪接与否等。选择性剪接过程受到许多顺式元件和反式因子的调控,并与基本剪接过程紧密联系,剪接体中的一些剪接因子也参与了对选择性剪接的调控。选择性剪接也是1个伴随转录发生的过程,不同的启动子可调控产生不同的剪接产物。mRNA的选择性剪接机制多种多样,已发现RNA编辑和反式剪接也可参与选择性剪接过程。     

鸡解偶联蛋白(UCP)基因内含子的克隆与系统发生树的构建

解偶联蛋白基因是新近发现的能够增加能量的消耗,与脂肪代谢和能量调控密切相关的一组基因。本研究根据小鼠UCP2基因的剪切方式,设计4对引物成功克隆测序了鸡UCP基因的全部5个内含子,发现都是GT-AG类型的内含子,鸡UCP基因的结构和小鼠的UCP2基因结构一致。以不同物种UCP基因的cds 区域序列和内含子2、内含子3序列进行系统发生树的构建,结果表明：以UCP基因cds区域序列构建的系统发生树与物种树是一致的,UCP基因可以作为研究动物群体系统演化研究的有效基因;但以内含子2与内含子3序列构建的系统发生树的结构则完全不是这样,与物种树的差别比较大。 Abstract:The UCP genes were the newly discovered genes that can increase the energy expenditure and involve in the metabolism of fat and regulation of energy.Four pairs of primers in chicken UCP exon region were designed to amplify the introns of chicken UCP gene according to the splice ways of the mouse UCP2 gene （Accession No.AF096288）.The sequence results showed that the chicken UCP gene also had five GT-AG type introns.The molecular phylogenetic tree was constructed based on the sequence of cds,intron 2 and intron 3 region,respectively.The phylogenetic tree based on the UCP cds region was consistent with the species phylogenetic tree.This result implicated that UCP gene can be regarded as the useful gene for the study of animal phylogenesis.On the contrast,the phylogenetic tree based on the intron 2 and intron 3 region was different from the species phylogenetic tree,which showed that the evolution of intron and cds region is different.     

核基因在鸟类分子系统发育学研究中的应用

核基因作为一种新的遗传标记,近年来被广泛应用于鸟类分子系统发育研究中.核基因与线粒体基因位于不同的遗传载体上,因此被引入到系统发育学研究中为物种树的重建提供独立的证据.常用的外显子标记为重组激活基因1(RAG-1),重组激活基因2(RAG-2),癌基因c-myc,原癌基因c-mos,它们由于缓慢的进化速率而被用于鸟类高级分类阶元的系统学研究中.常用的内含子标记是β纤维蛋白原基因内含子7(β-fibrinogen intron7,β-fibint7),肌红蛋白基因内含子Ⅱ(myoglobin intionⅡ).内含子标记通常与线粒体序列联合使用,形成具有互补系统发育信号的数据集,应用于各种分类阶元的系统学研究中.     

小细胞核核糖核蛋白体(snRNP)

大约十年前,人们在真核生物基因表达过程中,在细胞核中发现一种小细胞核RNA(snRNA),它与特殊的蛋白质结合成为小细胞核核糖核蛋白体(small nuclear ribonucle0pr0tein particle,简称snRNP),参与前体mRNA(pre-mRNA)的剪接。我们知道,真核生物的基因表达比较复杂,它的DNA碱基序列中包含编码序列称外显子,也插入非编码序列称内含子。DNA在核中转录出的mRNA同时含有外显子和内含子,不能做为模板翻译出蛋白质,而必须在细     

内含子Ⅱ的作用机制和演化

内含子是广泛存在于原核生物的叶绿体、线粒体以及真核生物基因组中的非编码DNA序列,但其含有的调控元件却常常影响基因的表达效率。内含子的自我剪接在mRNA的成熟过程中起着重要作用,内含子也可利用逆转录剪接作用插入到同源或异源DNA中,同时也常常通过“外显子改组”来促进基因进化。文章重点介绍了近年来在内含子Ⅱ作用机制及演化方面研究的最新进展。