梅花鹿S100A4 基因的克隆及融合蛋白的表达

为了研究梅花鹿S100A4 (S100 calcium binding protein A4)基因在鹿茸生长过程中的作用。用RT-PCR 法
从生茸骨膜细胞总RNA 中克隆了梅花鹿S100A4 基因,在NCBI 中对基因序列进行比对;将完整的基因序列与逆
转录病毒表达载体pLEGFP-C1 重组,获得了重组质粒pLEGFP-S100;用脂质体法将pLEGFP-S100 与pVSV-G (被
膜载体)共转染包装细胞GP2 - 293,获得重组病毒上清液,感染角柄骨膜细胞后逆转录病毒携带的基因进入宿
主细胞。结果显示:S100A4 基因是一个相对保守的基因,与多个物种的匹配度达到90% ;重组逆转录病毒载体
pLEGFP-S100 可以形成重组逆转录病毒粒子,将S100A4 基因导入靶细胞,并表达S100A4 与GFP (Green fluorescent
protein)的融合蛋白。     

Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的 构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法 应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果 酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论 本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总RNA为模板,分别用5’含EcoRⅠ、3’含BamHⅠ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物合成合信号肽全长IL－2、γ－IFN及α－TNFcDNA．然后将这些细胞因子cDNA分别重组入含筛选标记基因Neo的逆转录病毒载体LXSN中．采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系PA317．分别收集到含IFN－γ、TNF－α和IL－2基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒pLXSN的病毒上清这四种病毒颗粒用于导入人肝癌、胃癌细胞,可获得单克隆化的细胞因子基因修饰株PCR,Southern,RT－PCR及Northern杂交证明,有相应细胞因子及筛选标记基因的转入和表达生物活性分析也证实各基因修饰株细胞培养上清液中有一定活性的相应细胞因子．结果表明逆转录病毒介导的细胞因子基因转移是成功的     

Stanford基因治疗学家首次活体改变了神经元生理

Stanford大学(Stanford,CA)的三名科学家利用一种缺陷性疱疹病毒载体活体向大鼠脑中导入了葡萄糖转运(GT)基因。并且在这些动物的注射部位GT活性提高了10％。当人们用缺陷性单纯疱疹病毒(HSV)向脑细胞中活体导入标记基因,如lac Z基因时,Stanford研究小组则声明首次用HSV载体改变了成熟动物中枢神经系统(CNS)的生理学状况。 疱疹病毒被认为是一种向神经元中传送基因的理想载体。逆转录病毒载体只能向复制型细胞中传送基     

逆转录病毒介导的人血小板生成素(TPO)在骨髓基质细胞中的表达

为探讨逆转录病毒介导的TPO基因在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达,利用脂质体法将含TPO基因的逆转录病毒载体导入HF-CL细胞中,RT-PCR和基因组DNAPCR分析证实mRNA水平有表达,基因组中整合有Neo基因和TPO基因。TPO依赖细胞株TD-3检测生物学活性表明转染的骨髓基质细胞分泌TPO。上述结果为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血细胞的调控作用提供了必要的基础资料。     

大鼠卵黄囊的分化及其肿瘤性转化研究

目的研究12d大鼠胚胎脏层卵黄囊(VYS)向多胚层组织分化的潜能和在逆转录病毒感染下的肿瘤性转化特征。方法在不同培养条件、移植位点的条件下,观察VYS体内外分化的改变;另外利用逆转录病毒载体将荧光蛋白基因(GFP)转染12d卵黄囊细胞,对GFP标记的转化细胞进行体内外研究。结果在不同培养条件下,均对体外培养的或体内移植的大鼠卵黄囊向三个胚层分化的进程无特异的导向性。将荧光蛋白标记卵黄囊克隆细胞接种在裸鼠皮下长出了未分化的间质细胞肉瘤。结论12d大鼠胚胎脏层卵黄囊具有向三胚层分化的潜能;逆转录病毒感染导致卵黄囊间质细胞发生肿瘤性转化。     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因（mdr—1）导入小鼠？…

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。     

p16逆转录病毒载体的构建及其高滴度克隆的杂交筛选

构建多肿瘤抑制基因 p1 6( mts- 1 )的逆转录病毒载体 ,用一种简便的非放射性杂交方法 ,从多个包装细胞克隆中筛选出病毒滴度高的克隆 ,以提高病毒转导效率 .以 p1 6c DNA全长为目的基因 ,构建逆转录病毒载体 p LMSN,非脂质体转染试剂转染兼性包装细胞 PT67,G41 8筛选抗性克隆 ,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒 RNA( v RNA) ,以碱性磷酸酶直接标记的目的基因为探针作斑点杂文 ,化学发光自显影法定量测定 ,在短时间内从多个候选克隆中筛选出高产毒的克隆 .为 p1 6基因治疗的实验研究奠定了物质基础 .     

DNA基因库的同源重组筛选

专利为鉴别和分离真核寄主基因库中目标DNA的同源重组法(Ⅰ),包括:(a)制备真核细胞DNA基因库,其中可发生导入DNA与寄主细胞现有DNA间的重组;(b)导入在真核寄主细胞中可复制并含选择性标记基因,与目标DNA部分同源的DNA序列的目标DNA载体质粒YIp;(c)重组;和(d)选择转化体。专利还包括:(1)用(Ⅰ)分离到的哺乳动物、人或植物DNA或基因;(2)带至少缺失1个选择性标记染色体的酿酒酵母TD7-16d、IV-16d和MGD131-10;(3)质粒p184DLARG及其功能性等同物;(4)在     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果　重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论　SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。显示了其潜在的临床应用价值     

体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究

通过逆转录病毒将4个基因(Oct4 、 Sox2、c-Myc和Klf4)导入小鼠胚胎成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblast, MEF)中,能诱导形成胚胎干细胞样特性的诱导多能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞.人类iPS细胞的成功构建开拓了广泛的应用前景.本文简要综述了 iPS细胞的基因筛选,转导基因的选择以及iPS细胞的表观遗传特性等.     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达１．２×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性ＣＦＵ－ＣＭ检测,其基因转移效率可达７．０％。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后４个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性     

稳定表达呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1细胞的构建及其生物特性研究

获得稳定表达RSV病毒NS1基因的HEp-2-NS1细胞株并对其生物学特性进行初步研究。采用RT-PCR方法从RSV病毒中获得NS1全长基因,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,重组载体与包装质粒PIK通过磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT细胞,产生的逆转录病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达细胞株,用QPCR、细胞病变染色法、RT-PCR和间接免疫荧光法检测细胞中NS1 mRNA和蛋白表达情况。结果表明重组逆转录病毒载体pBABE-NS1经双酶切及测序鉴定正确;筛选获得5株阳性单克隆细胞株,QPCR结果显示HEp-2-NS1细胞有NS1基因扩增,其中d株的相对表达量是正常细胞对照组的8 483倍;在外源干扰素作用下,HEp-2-NS1细胞仍对VSV病毒保持敏感,细胞感染病毒48h后染色结果显示全部死亡;对第3代及第30代细胞的RT-PCR和间接免疫荧光法检测结果显示,导入的NS1基因在HEp-2细胞中不仅能转录成相应的mRNA而且能成功稳定地表达。成功构建了稳定表达RSV病毒非结构蛋白NS1的HEp-2-NS1改造细胞株,为建立适用于临床分离的转基因细胞提供良好的基础。     

LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响

目的构建包含LM03（LIM-only3,LM03）全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LM03对SK-N-AS细胞增殖的影响。方法将质粒pEGFP-Cl-一LM03经EcoRI和BamHI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导人包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western印迹鉴定,检测LM03感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况。结果获得了能正确表达LM03基因的重组逆转录病毒表达载体pLX-SN-LMO3;LM03基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LM03感染组G1／G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48h后,LM03感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N．AS组（P〈0．05）。结论成功构建了LM03基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0／G1期进入S期,从而促进细胞的增殖。     

靶向WNT5A基因的shRNA逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.方法:根据人WNT5A基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pSUPER Retro RNAi质粒,构建WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体,经脂质体介导入GPG293细胞,包装成逆转录病毒.用该逆转录病毒感染人鼻咽癌细胞,Western blot法和RT-PCR检测细胞WNT5A的表达.结果:目的序列成功连接于载体并包装成逆转录病毒,免疫印迹检测和RT-PCR检测结果表明构建的WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体能显著抑制鼻咽癌细胞WNT5A的表达.结论:成功构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

小鼠胚胎干细胞中RNA干涉现象

报道了不同品系小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )系MESPU13、B3和R1中存在的RNA干涉 (RNAi)现象。应用脂质体法 ,将转录绿色荧光蛋白 (GFP)基因双链RNA(dsRNA)的载体 (pdsGFP)转染GFP标记的ES细胞 ,dsRNA的瞬时表达可引起ES细胞中的RNAi效应 ,即质粒转录的GFP基因的dsRNA能够显著降低ES细胞内相应的外源GFP基因的表达 ;同时 ,用电穿孔转染法将线性化的pdsGFP puro导入ES细胞中 ,筛选后 ,在 3 0 %左右的抗性克隆中GFP表达量明显降低 ,少数细胞内的干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。在此基础上 ,构建了可转录ES细胞特异标记基因OCT 4基因片断dsRNA的载体 ,经基因打靶和抗性筛选得到了稳定整合的ES细胞克隆 ,随机扩增了 5 1个克隆 ,并对其中的 48个阳性克隆进行了PCR半定量检测 ,结果显示 :在 11个ES细胞克隆中具有显著的RNAi效应 ,干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。这一结果表明 ,应用RNAi在不同品系ES细胞中研究哺乳动物及人的基因功能是可行的     

有待寻找高效率的转染技术

基因转移是进行基因治疗最关键的技术。要求转移至靶细胞的基因安全、忠实和长效表达。逆转录病毒是目前发展较快的一种载体,它可用于体内外转染细胞。打孔球囊导管(perforated balloon catheter)可将逆转录病毒载体导入心血管组织中,为基因转移常见方法之一。Fligelman等应用打孔球囊导管将含病毒颗粒(virions)的逆转录病毒载体注入兔主动脉,时间仅1min,且不需结扎血管(以往实验需结扎30min)。实验分三组:注射含β-半乳糖苷酶     

人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立

为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒配基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在PK-15细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。