木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅳ.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析

拟康氏木霉纤维素酶高产变异株EA_3-867和N_2-78在合成培养基琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落明显缩小,生长变慢。但在蛋白胨酵母膏琼脂平板上,小菌落恢复成大菌落,生长速度同野生型菌株一致。EA_3-867和N_2-78在不同液体培养基中纤维素酶活力均显著高于野生型菌株1096和木_3。洗涤菌丝体的诱导测定也证明高产变异株的纤维素酶诱导活性有明显的提高。变异株和野生型菌株洗涤菌丝体诱导形成的纤维素酶组分,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱判断,未见明显差异,仅变异株中代表纤维素酶活性的蛋白带显著加深。高产变异株纤维素酶产量的增加是由于菌株对诱导剂敏感性的增加和对降解物阻遏敏感性的减弱。     

斜卧青霉A10产纤维素酶的酶学性质研究

以斜卧青霉（Penieillium decumbens）A10为出发菌株,经450Gy ^60Coγ-射线诱变处理,选育出一株具有较高纤维素酶活力且传代稳定的正突变株A50,发酵60h后,其CMC酶活和滤纸酶活分别为27．28IU／mL和1．98IU／mL,较出发菌株A10分别提高了33．2％和45．59％。对突变株A50的产酶组分进行研究,通过SDS—PAGE电泳分析,从蛋白质水平上证明突变株A50确实是A10在遗传物质上发生改变的菌株,其CMC酶活最适作用pH值为4．0,最适作用温度为60℃;而滤纸酶活的最适作用pH值为5．2,最适作用温度45℃,二者在一定范围内具有较高的稳定性。     

强启动子glaA介导cbhB基因在黑曲霉中的表达

黑曲霉纤维素酶三类不同酶系中,纤维二糖水解酶基因表达处于很低水平,导致纤维素酶总体活力水平不高。为构建黑曲霉纤维素酶高产菌株,采用基因工程方法,全基因合成拼接黑曲霉高表达葡萄糖淀粉酶基因glaA的强启动子片段与纤维二糖水解酶基因cbhB编码区片段,然后将杂合基因克隆到二元载体pCAMBIA1301上,重组质粒通过农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子,携带杂合基因的T-DNA片段插入到黑曲霉转化子的染色体上,共筛选到48个具有潮霉素抗性的转化子。纤维素酶活力水平测定结果显示,转化子A3-9的CMC酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株的1.31倍;转化子B1-7与A3-6的滤纸酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株2.51倍。另外,初步分析了杂合基因在黑曲霉中的表达所需的诱导条件。     

绿色木霉纤维素酶高产突变型的诱变和筛选

1.通过各种化学和物理因素的复合处理,诱发T.viride 285的变异,得到9株较好的突变型。其中典型的是绿色突变型408-2,其纤维素酶活较高、稳定,平均CMC酶活为101毫克/毫升,滤纸酶活为9.3毫克/毫升,比亲本菌株提高3倍。 2.在所使用的诱变剂中以紫外光和亚硝酸为好,特别是将它们进行复合处理时效果更佳。诱变时,降低诱变剂的相对剂量,即缩短处理时间,正变率大幅度提高。     

产中性纤维素酶特异腐质霉H31-3复合诱变研究

中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业均具有广泛的应用。采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉（Humicola insolens）H31-3进行诱变,经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株H14,制备其原生质体后进行紫外诱变。筛选后得到正突变菌株H14．2,最终CMC酶、滤纸酶活力分别达82．56IU／mL和5．77IU／mL,较原始菌株提高了78．57％和106．81％。     

产纤维素酶菌种TP1202的选育及产酶条件研究

从腐木上分离到1株纤维素酶活较高的野生纤维素酶产生菌TP01,经鉴定为绿色木霉（Trichoderma viride)。以TP01为出发菌株,经紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯和LiCl等物理化学诱变处理,最后得到1株高产突变株TP1202。通过对培养基中氮源、碳源、培养温度、培养时间、培养基的含水量、培养基的起始pH、培养基中葡萄糖含量的研究,测定Trichoderma viride TP1202纤维素酶的CMC和滤纸酶活,找到了产纤维素酶的较佳条件,即,稻草粉：麦麸=4：1,物料：水份=1:0.75-1,以（NH4）2SO4或NH4Cl为氮源,葡萄糖含量为1%-2%,起始pH为7.5,在30℃下培养96-120h左右,其酶活力为最高,每克干曲CMC酶和滤纸酶活分别达到28900U、604U,是出发菌株的3倍和6倍。     

秸秆纤维素分解菌的酶活力测定

目的:测定秸秆纤维素分解菌的酶活力。方法:从土壤中分离出具有分解纤维素能力的菌株,采用刚果红染色法进行粗选,得到7株透明圈较大的菌株。将这7株菌株液体发酵培养6d,再分别用滤纸分解度观察、羧甲基纤维素酶活法(CMC)、滤纸酶活法(FPA)和天然纤维素酶活法测定其酶活力。结果:在7株菌株中,F-1、F-2、F-3、F-5的酶活力测定结果与其溶解圈的测定结果、滤纸分解结果基本相同。且天然纤维素酶活力高的菌株,其CMC酶活、FPA酶活也高,滤纸分解效果也比较明显。结论:CMC法、FPA法和天然纤维素酶活法适于测定秸秆纤维素分解菌的酶活力。     

棉秸秆降解高温菌株的筛选及产酶分析

从新疆地区分离具有降解棉秸秆纤维素功能的菌株,得到4株耐高温真菌(50°C)。纤维素酶学性质分析表明,该4株菌的纤维素酶具有良好的耐酸性(最适pH为4.5)和耐高温性(最高达60°C)。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、微结晶纤维素、棉花、滤纸、淀粉、果胶为底物测定酶活力,滤纸酶活力(FPA)最高达2.63 U/mL、淀粉酶活力最高达6.17 U/mL、果胶酶活力最高达5.86 U/mL。4株真菌酶学特性分析表明,该系列菌株在秸秆生物质利用方面有很大的应用潜力。     

黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

从酒由中选育得到产耐酸性α-淀粉酶的嗜酸性黑曲霉菌株Tx-78,经酒精沉淀,CM52和DE52纤维素离子交换层析对该酶进行纯化,通过SDS-PAGE检验其纯度并测得其分子量为74 ku.该耐酸性α-淀粉酶具有显著的热稳定性及酸稳定性.其最适反应温度与pH分别为70℃和pH 4.0.当反应温度低于60℃时,该酶在pH 4.0条件下可保持稳定活性达3 h以上.Ca2 、Ba2 对提高酶活力具有明显作用.薄层层析表明该酶制剂水解淀粉最终产物主要为麦芽糖和葡萄糖.     

纤维素降解菌青霉T24-2的分离及产酶特性

从稻田腐烂秸秆中分离到一批纤维素分解菌株。通过滤纸崩解测试、刚果红纤维素平板识别,以及产酶鉴定,筛选得到一株分解纤维素能力较强的真菌。经形态观察和18S r DNA基因片断分析,鉴定该菌株为青霉。对菌株的液态发酵条件进行研究,该菌株培养基含3%稻草粉、0.25%尿素和无机盐营养液,最佳产酶条件为:自然pH,30℃,130r/min发酵4d。该菌株的CMC酶活和滤纸酶活最高分别达到45.01I U/mL和6.89I U/mL。随后对该菌酶解稻草粉进行研究,糖化率达到40.17%。研究表明,青霉T24-2菌株在秸秆综合利用上具有良好的应用前景。     

青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株的选育

从土样中筛出一株生长快,产纤维素酶较高的斜卧青霉(Penicillium decumbens114-2)。能在全纤维素(hlocellulose)双层平板上形成清晰的透明圈。摇瓶培养的滤纸酶活可达8.8mg 葡萄糖/ml.h。 114-2菌株(其纤维素酶合成可为葡萄糖所阻遏)经UV和NG诱变处理后,在含葡萄糖的全纤维素平板上筛选到多株仍能形成明显透明圈的突变株。其中JN15和JU1在含葡萄糖的全纤维素液体培养基中,在残余葡萄糖浓度为 1％左右时,滤纸酶活可分别达到7.3 和13.9mg葡萄糖ml·h。这是出发株114-2和纤维素酶高产菌株木霉EA_3-867和QM9414所不能的。在不加阻遏剂的对比试验中,两个突变株的纤维素酶产量都比较高。其中,JU1的滤纸、CMC和棉花酶活分别达到33mg葡萄糖/ml·h,234mg葡萄糖/ml·h和86mg葡萄糖/ml·24h。     

纤维素降解菌Aspergillus sp. YN1的产酶条件及酶学特性

从牛羊粪堆肥中筛选出一株纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1,主要研究了液体发酵培养基中碳源、氮源、培养温度、起始pH、通气量以及接种菌龄对菌株YN1的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)及滤纸酶活的影响。研究结果表明,在优化条件下,该菌的CMC酶活、滤纸酶活在培养第3天分别达到0.53U/mL和0.15U/mL。在酶学特性研究中,菌株YN1的CMC酶的最适反应温度为70°C,最适反应pH4.0(酶促反应为30min)。用不同温度处理1h或不同pH处理2h,YN1的CMC酶在30°C?50°C或pH3.0?4.0之间仍可保持80%以上的酶活性,对热及酸表现出较高的稳定性。     

康氏木霉B—7纤维素酶的产生条件及酶学性质研究

野生型康氏木霉８５４－Ｂ２经多种理化诱变因子及空间微重力辐射等因素的处理,选育到１株高活力纤维素酶变异株Ｂ－７。其固体培养物的纤维素酶,以滤纸为底物酶活力为３４μ／ｇ,以羧甲基纤维素（ＣＭＣ）为底物酶力为１４７２μ／ｇ。与野生菌８５４－Ｂ２相比,产酶活力水平分别提高５倍和７倍多。酶在滤纸上作用的最适条件为ｐＨ４．５－５．０,温度５５－６０℃;２５℃,保温２４ｈ,ｐＨ稳定范围为ｐＨ４．０－６．５;７     

绿色木霉纤维素酶高产突变型的诱变和筛选

    1．通过各种化学和物理因素的复合处理，诱发T. vi,ide 2” 的变异，得到9株较好的突变型。其中典型的是绿色突变型403-2，其纤维素酶活较高、稳定，平均CMC酶活为101毫克／毫升，滤纸酶活为9.3毫克／毫升，比亲本菌株提高3倍。    2．在所使用的诱变剂中以紫外光和亚硝酸为好，特别是将它们进行复合处理时效果更佳。诱变时，降低诱变剂的相对剂量,即缩短处理时间，正变率大幅度提高。    3.诱变之前采用限量培养液使抱子萌动，可以降低相对剂量，增加抱子对诱变剂的敏感性，提高突变率，增加正变效果。    4.经诱变后得到的突变型遗传性不易稳定，往往发生退化。试验证明，用连续优势选择方法可以选育出种性纯、产量高而稳定的突变型。     5. C 酶是降解夭然纤维素必不可少的成分，因而，用C,酶活表示纤维素酶的离低，菌种的好坏是合理的。测C,酶的底物最好是滤纸。     

康氏木霉B－7纤维素酶的产生条件及酶学性质研究

野生型康氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉ）８５４－Ｂ２经多种理化诱变因子及空间微重力辐射等因素的处理,选育到１株高活力纤维素酶变异株Ｂ－７。其固体培养物的纤维素酶,以滤纸为底物酶活力为３４μ／ｇ,以羧甲基纤维素（ＣＭＣ）为底物酶力为１４７２μ／ｇ。与野生菌８５４－Ｂ２相比,产酶活力水平分别提高５倍和７倍多。酶在滤纸上作用的最适条件为ｐＨ４．５—５．０,温度５５—６０°Ｃ;２５°Ｃ,保温２４ｈ,ｐＨ稳定范围为ｐＨ４．０—６．５;７０°Ｃ保温３０分钟,剩余酶活力３４．４％。     

1株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及生长特性

分离筛选高效降解纤维素的菌株,并研究其生物学特性。利用刚果红染色法从腐烂的玉米秸秆中分离纤维素降解菌,再通过测定滤纸的降解率及多种酶活复筛。综合考虑水解圈和菌落直径(HC值),滤纸的降解率和酶活,对所筛选的菌株进行纤维素降解能力综合评价,最终获得1株具有纤维素降解能力的菌株DX4,其滤纸酶活(FPA酶活)、内切葡聚糖酶活力(CMC酶活)和外切葡聚糖酶活力(Cex酶活)分别为256.051、358.276和5.536 U/m L。结合形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定,将该菌株鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis DX4,简称BS-DX4。研究表明,BS-DX4的最适生长温度为40℃,最适生长pH为7.0,低盐浓度下生长旺盛,是具有开发潜力的纤维素酶高产菌株。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节I.槐糖对木霉EA3-867纤维素酶形成的诱导作用

在槐豆荚提取液中分离到白色针状的槐糖结晶,该糖对拟康氏木霉(Trichoderma pseudo-Koningii Rafai) EA3-867的纤维素酶(C1和Cx)有强力的诱导作用。在纤维素酶活力,尤其是产酶速度上明显超过纤维素的诱导作用。槐糖的诱导作用与添加槐糖的时间和菌种有关,并受甘油强烈阻遏。在以纤维二糖(0．5％)为碳源培养时,木霉EA3-867也能较迅速地形成纤维素酶,但在EA3-867的甘油培养物中加入纤维二糖(5×10-3M)并不能诱导Cx酶。槐糖和纤维素对纤维素酶的诱导作用,无论在诱导胞外和胞内纤维素酶的成分上或从凝肢电泳图上,都十分相似。作者认为木霉EA,一867的纤维素酶形成同时受诱导一阻遏机制调节,并对组成型和诱导型的纤维素酶的作用,以及固体纤维素对纤维素酶可能的诱导机制作了推测。     

EA_3—867纤维素酶的简易冷冻干燥法

近年来,为开展植物原生质体培养和细胞杂交研究,我们利用木霉EA_3—867菌株发酵,制备纤维素酶,并对该酶的性质进行了研究。酶制剂活力和质量不仅与菌株种类、发酵过程的条件等,而且与最后干燥方法有关。最     

分离植物原生质体的纤维素酶的制备及性质

EA_3-867纤维素酶是由绿色木霉变异株EA_3-867,用稻草粉发酵提取,经过饱和硫酸铵沉淀,分子筛脱盐,冰冻干燥制成的。酶制剂在水中溶解度高,酶活力较稳定,它含有纤维素酶(C_1,C_x)、果胶酶、半纤维素酶等组分,是一种比较理想的分离植物原生质体的复合酶。我们用EA_3-867酶制剂已从20多种植物材料中分离出大量完整的原生质体,并把烟草的叶肉组织或愈伤组织的原生质体培养分化成植株。EA_3-867纤维素酶制剂的成功制备为我国进一步开展植物原生质体和体细胞杂交等研究提供了有利条件。     

产果胶酶的菌种选育及发酵条件

炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)AS 3.396经亚硝基胍和Co60r-射线诱变,获得一株高产果胶酶突变株G5512。该菌株的发酵滤液,以高酯果胶为底物的酶活力为860u／ml;以低酯果胶为底物的酶活力为1227u／ml。产酶活力水平约为原出发菌株的2—6倍。产酶最适培养条件为：起始pH4.0—4.5,30℃,72—90小时。酶作用最适条件为：高酯果胶为底物时,pH3.5,50℃;低酯果胶为底物时,pH4.5,50℃。pH稳定范围为2．0-6．5(高酯果胶)和4.5—5.0(低酯果胶)。酶在60℃保温15分钟,高酯果胶为底物的酶剩余活力71％,低酯果胶为底物的酶活力仅剩余1％。