一株产高温蛋白酶嗜热菌A-2的筛选鉴定及酶学特性分析

本研究为从云南腾冲热泉中分离纯化得到一株产高温蛋白酶的菌株并对其进行驯化培养,用以探究该菌株的生长条件及酶学特性,通过选择培养基筛选能够分解脱脂奶粉产蛋白酶的菌株,应用常规方法液体培养菌体,探究温度、pH、碳源、氮源对菌株生长情况的影响,并采用福林酚法测蛋白酶活性。并提取蛋白酶液对酶的最适pH、温度以及热稳定性、pH稳定性进行研究。结果发现通过含脱脂奶粉的固体培养基筛选得到一株产蛋白酶菌株A-2,经过生理生化试验和16S rDNA鉴定知该菌种属于Aneurinibacillus属。酵母粉、葡萄糖、55℃、pH值7.5分别为菌株生长的最适氮源、碳源、温度和pH。此外该菌株所产的蛋白酶最适温度为60℃,在pH值7~9具有较好的酶活性。因此,该菌株为嗜热芽孢杆菌,所产的碱性蛋白酶具有较高的耐受温度和pH稳定性,为进一步开发利用提供参考的价值。     

产碱性蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

通过测量比较在碱性蛋白平板上产生的蛋白水解圈直径,从土壤中筛选到一株高产蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079,根据生理生化特性、16S rDNA序列,鉴定为B.amyloliquefaciens。其最适培养温度为35°C-37°C,最适生长pH 8.0,在特定培养条件下16 h达到稳定期,菌体生长和蛋白酶合成同步进行。以大豆分离蛋白为氮源时发酵液具有最高酶活。发酵液在pH 10时具有最高酶活,表明为碱性蛋白酶。该菌株产生的碱性蛋白酶可水解多种天然蛋白质,对胶原蛋白水解度高于其他蛋白质,对羽毛角蛋白也有一定水解能力,提示该酶具有一定新颖性。     

蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii对食用油脂的利用效率研究

筛选具有利用食用油脂功能的菌株,为废弃食用油脂的资源化应用开展基础性前期研究。利用油脂中性红平板筛选法筛选到1株具有脂类降解能力的菌株鉴定为蒙氏假单胞菌。通过菌株形态特征扫描、生理生化特性,进而利用分光光度法探索了该菌株最适温度、最适pH等生长条件。并研究其在最适生长条件下的生长曲线及其在不同油脂作唯一碳源条件下的生长情况。结果表明,该菌株生长的最适温度为28℃、最适pH值为7.0、最适盐度为2g/L,达到最大培养生物量的时间为7h。对玉米油、动物油、花生油、芝麻油、椰子油、橄榄油共7种食用油脂具有相应的利用能力。     

一株产碱性蛋白酶菌株的筛选鉴定及酶学特性研究

【目的】从丝茅草中筛选得到产蛋白酶菌株并研究驯化过程中微生物群落结构,以及探究该菌株的生长特性和蛋白酶的酶学特性。【方法】通过高通量测序探究来源于丝茅草的菌株在不同培养条件下细菌种类及丰度,通过选择性培养基来筛选能够分解酪素并产生蛋白酶的菌株,通过单因素试验方法确定环境因子对菌株生长和蛋白酶活性的影响。【结果】微生物群落结构在基础培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中不同。通过含酪素的选择性培养基里筛选到1株产蛋白酶菌株H-16,经生理生化试验和16S r DNA鉴定知该菌株属于Escherichia marmotae,菌株H-16能产生分子量为70 k Da左右的单亚基蛋白酶。胰蛋白胨、蔗糖、30°C或35°C、p H 7分别为菌株生长的最适氮源、碳源、温度和p H。菌株H-16分泌的蛋白酶最适p H为6–8,在50°C及6%盐度以下酶活性几乎不受影响。此外,Cu(II)和Ag(I)等金属离子能够抑制蛋白酶的活性。【结论】该菌株H-16为嗜中温菌株,能够产生碱性蛋白酶。     

一株降解牛血液蛋白菌株的分离鉴定及其降解条件优化

为了解决屠宰场废弃血液造成的环境污染及其有效利用问题,取样自日喀则地区屠宰场的废弃血液堆积土壤,梯度稀释涂布于血琼脂平板上进行分离,挑选有较大溶血环的菌落纯化,继而保藏菌种。对保藏菌株进行形态学、生理生化、16S rRNA基因序列鉴定并进行药敏试验、菌株生长条件的探究。用福林酚法测定保藏菌株的蛋白酶活力,初步优化血液培养基条件,提升保藏菌株血液降解效率。结果表明,得到了一株高效降解血液蛋白的菌株,编号为NWMCC0047,经过形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列鉴定,表明该菌株为乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)。其蛋白酶活力可达19.00 U/mL。最适生长条件：碳源为葡萄糖、氮源为牛肉膏、无机盐为磷酸氢二钠、pH值为7、温度为20℃。通过菌株对牛血液蛋白降解条件的初步优化,当血液添加量为10%(体积分数)、麦麸添加20 g/L、不添加无机盐、37℃培养85 h时,其降解率可达21.97%。实验为降解废弃血污提供了简单可参考的操作方法且为生产氨基酸肥料提供候选菌株。     

红树林微生物DH-2胞外蛋白酶的性质及产酶条件优化

从大亚湾红树林土壤样品中分离得到产蛋白酶菌株,鉴定所产胞外蛋白酶的酶学性质以及菌株的最佳发酵培养条件。采用平板透明圈法筛选菌株,福林酚显色法测定蛋白酶的酶活,通过单因素和正交试验确定其最佳发酵培养基以及发酵条件。从壤样品中分离得到一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌DH-2,该菌株分泌的蛋白酶最适反应pH和温度分别为8.0和65℃,50℃保温处理60 min后,剩余酶活仍保留80%以上。该蛋白酶对多种金属离子、有机溶剂及表面活性剂均有较好的耐受性。确定该菌株产蛋白酶的最适条件:1%(m/V,下同)可溶性淀粉,1%胰蛋白胨、1%NaCl,初始pH 5.5及7%的接种量,40℃培养36 h。在最适条件下测得其发酵液的酶活为236.30 U/mL,约为初筛时的酶活的8倍。该蛋白酶具有较为广阔的作用温度和pH范围,金属离子、有机溶剂及表面活性剂耐受性好,酶的性质比较稳定。     

产大米蛋白水解酶的菌株筛选、酶学性质及制备大米寡肽

【目的】旨在分离、筛选并鉴定具有大米蛋白降解作用的菌株及其关键蛋白酶,为高效制备大米寡肽提供制备酶及最优制备条件。【方法】以"水解圈"为评价指标,从粮食仓库附近土壤筛选获得具有降解大米蛋白能力的菌株;通过16S rRNA序列分析确定菌株归属;利用单因素实验获得最佳氮源并初步分析酶学性质;利用HPLC检测寡肽得率,并对制备条件进一步优化。【结果】经鉴定具有大米蛋白降解作用的菌株为沙雷氏菌(Serratia sp. JWG-D15),以大米蛋白为氮源培养菌株JWG-D15,蛋白酶So PRO产量最高,其最适温度40℃,最适pH 8.0;在加酶量20 U/mg,大米蛋白浓度40 mg/mL,40℃,4 h条件下寡肽得率最高72.38%。【结论】以大米蛋白为氮源培养菌株JWG-D15,蛋白酶So PRO产量最高;蛋白酶So PRO制得的大米寡肽,其得率是目前行业最高。本研究既丰富了大米寡肽的制备用酶的种类,又为深入大米寡肽产业化提供一定理论基础。     

产低温蛋白酶极地菌株的筛选及Pseudoalteromonas sp. QI-1产蛋白酶粗酶性质

通过酪蛋白平板法从实验室极地微生物资源库中筛选到130株在低温条件(4℃)下具有蛋白酶活性的菌株,并对部分酪蛋白水解圈较大的菌株进行了酶活测定和系统发育分析。发现酶活较高的8株菌分别属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。选择低温蛋白酶活性较高的菌株Pseudoalteromonas sp.QI-1为研究对象,以酪蛋白为反应底物对其所产低温蛋白酶粗酶酶性质进行初步研究。结果表明:QI-1低温蛋白酶酶活最适反应温度为40℃,在0℃时保持10%的相对酶活,酶活最适反应pH为10.0;其催化作用不需要金属离子的参与;热稳定性极差,在60℃放置15 min即完全失活。     

四株冰川雪细菌产酶能力的初步研究

目的:从青藏高原冰川雪中筛选出一菌多酶的菌株.方法:对恢复出的4个细菌,通过平板透明法研究其产淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的特性.结果:LHG-C-9为惟一可以产淀粉酶的菌株,所产脂肪酶活性最高.4个菌株均不产蛋白酶.结论:LHG-C-9最适生长温度为15℃,属于耐冷菌.对该菌所产淀粉酶和脂肪酶的性质进行了初步研究,其随产淀粉酶的最适作用温度为50℃;最佳产酶pH值为7.0,该pH值所产酶活为83.9U/mL;在60℃的高温下温浴10min后酶活为0%.该菌株所产脂肪酶的最适作用温度为20℃;最佳产酶pH值为7.0,该pH值所产酶活为9.2U/mL;50℃温浴1h后酶活力不足34%.     

嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅰ.菌种分离、筛选及发酵条件的研究

从38份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌R115,能在pH10以上的环境中生长,并在pH10条件下产生较高的碱性蛋白酶。酶反应的最适pH为10.5,最适温度45℃;在pH12条件下最适温度为28℃。     

一株油菜菌核病拮抗真菌的鉴定及生物学特性研究

从兰科植物羊耳蒜根部分离并筛选对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum具有较强拮抗作用的内生真菌,确定其分类地位,并对其体外培养特性进行研究。利用常规PDA培养法进行内生真菌的分离、培养,采用平板对峙法筛选具有较强抑菌活性的菌株并对其进行种类鉴定,同时设定不同碳源、氮源、温度和p H值条件研究该菌株的生物学特性。通过筛选获得1株对油菜菌核病菌具有较强抑制作用的真菌菌株,结合形态学特征和ITS分子序列分析将其鉴定为多节孢属Nodulisporium sp.。该菌株对碳源要求不严格,以麦芽糖、果糖、葡萄糖和蔗糖为碳源均能良好生长。氮源对该菌株生长具有显著影响,最适氮源为牛肉膏。其最适培养温度为25℃,且温度低于10℃或高于30℃时菌丝生长均受到明显抑制。同时该菌株能耐受较广的酸碱度范围,在p H5-9范围内均生长良好。     

土壤中高产蛋白酶菌株产酶条件及酶学性质

【背景】微生物蛋白酶已经成为工业用蛋白酶的主要来源,筛选具有特殊环境适应性的微生物成为生物酶资源的开发热点。【目的】通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选、优化及相关特性研究,寻找新的蛋白酶资源,为高原菌种资源利用提供科学依据。【方法】采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定,利用单因素试验和正交试验对菌株进行发酵条件优化及酶学性质的探究。【结果】筛选出一株高产蛋白酶菌株XC2,经鉴定菌株XC2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC2最优产酶条件:可溶性淀粉4.0%,牛肉膏1.0%,K~+0.6%,培养温度34°C、初始pH 7.0、接种量2.0%的条件下200 r/min振荡培养13 h,所产蛋白酶活力最高为638.5 U/mL。XC2所产蛋白酶最适反应温度60°C,最适pH9.0;40-50°C、pH8.0-10.0条件下酶活稳定性较高;Mn~(2+)对酶活力有明显激活作用,而Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+对酶活力有明显抑制作用。【结论】枯草芽孢杆菌XC2有较强的产碱性蛋白酶的能力,具有较好的应用前景。     

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达

摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。     

68株北极产蛋白酶菌株的筛选、鉴定以及部分酶学性质

【目的】从北极海水样品中分离产蛋白酶细菌,并对其进行初步的分类鉴定,为低温蛋白酶的低温适应性及其应用研究奠定基础。【方法】通过酪蛋白筛选培养基低温培养的方法从北极水样中分离出68株产蛋白酶细菌,采用16S rRNA基因PCR-RFLP(限制性酶切多态性)方法及传统的表型特性分析对所分离纯化的菌株进行分类,每种细菌类型各取1株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定、GenBank数据库blast分析以及通过DNAMAN软件进行系统进化树分析。对代表菌株的蛋白酶酶学性质进行初步研究。【结果】68个菌株可归为3种类型(54.41%、42.65%和2.94%),分别以菌株6、11和52为代表菌株。16S rRNA基因序列分析结果表明,菌株11与比目鱼黄杆菌(Chryseobacterium scophthalmum)具有98.24%的同源性;菌株52与嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)具有98.55%的同源性;菌株6与Stenotrophomonas rhizophila具有96.50%的同源性,可能为该属的新物种。对3种类型代表菌株进行表型性状研究显示,菌株6、11和52为革兰氏阴性、直杆状、不产胞外脂肪酶和淀粉酶,具有强的蛋白酶活性。菌株6的蛋白酶最适酶活温度为55℃,最适宜pH为6.7;菌株11的蛋白酶最适酶活温度为40℃,属于低温酶,最适酶活pH约为8.5;菌株52的蛋白酶最适酶活温度为65℃,最适酶活pH为7.4。【结论】本文首次报道了Stenotrophomonas和Chryseobacterium的菌株在北极海水样品中的分布,充实了极地产蛋白酶菌的种属分布多样性,为后续低温蛋白酶的研究和应用奠定了基础。     

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究

从深海的38份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY－A,其最适生长温度为10℃,能适应较大范围的pH值和盐度,此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶,不利用单一氮源,最适产酶条件为,pH10.0,10℃,接种量0．5％,200r/min摇床培养40－72h,粗酶液的最适作用温度为40℃,最适pH值为10,在pH9-12内稳定,是一碱性蛋白酶。     

一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离、鉴定及酶学特性

【目的】筛选产蛋白酶嗜碱菌并对其进行鉴定和特性分析。【方法】利用碱性脱脂牛奶培养基分离纯化产蛋白酶嗜碱菌,通过形态特征、生理生化、16S rRNA基因序列分析以及DNA-DNA杂交实验确定菌株的分类地位,利用酪蛋白水解法分析所产蛋白酶的pH和温度作用范围、稳定性和耐氧化剂能力。【结果】从我国西藏盐碱湖样品中分离到一株产碱性蛋白酶的菌株ZL223,该菌株为革兰氏阳性菌,最适生长温度为37℃,最适生长pH9.0,16S rRNA基因序列分析显示,菌株ZL223与假强芽孢杆菌Bacillus pseudo firmus OF4亲缘关系最近,16S rRNA基因序列相似性为98.6%,DNA-DNA杂交结果显示与B.pseudofirmus OF4同源性为86%。菌株ZL223产生的蛋白酶作用的最适pH为12.0,最适温度为40℃。【结论】结合生理生化指标测定的结果,鉴定菌株为假强芽孢杆菌ZL223(B.pseudofirmus ZL223)。该菌株产生的碱性蛋白酶具有较高的pH适应性,值得进一步研究。     

1株血红蛋白分解菌的分离鉴定及其蛋白酶活力测定

为了获得能够有效降解利用屠宰场废弃血液的功能菌株,以日喀则地区屠宰场废弃血液堆积土壤样品为材料,将样品稀释涂布接种在血平板上进行分离,挑取水解圈最大的菌落进行平板划线纯化。对分离菌株进行形态学、生化反应试验、16S rDNA序列鉴定并测定其蛋白酶活性。筛选出1株能够高效降解血红蛋白的菌株命名为NwMCC01910042,该分离菌株为革兰阳性杆菌,V-P(Voges-Proskauer)试验阳性,枸橼酸盐利用、淀粉水解、明胶液化、16S rDNA序列系统进化分析显示NwMCC01910042菌株与Bacillus licheniformis ATCC 14580株的序列相似性为99.79%,与Bacillus licheniformis MSL3076株的序列相似性为99.30%,为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis),该菌株的16S rDNA序列已提交至GenBank,准入编号为MN 176417,其蛋白酶活力为188.63 U/mL。利用微生物降解生产氨基酸有机肥的关键是筛选蛋白酶的高产菌株,NwMCC01910042株菌有望作为将废弃血污降解为氨基酸的候选功能菌株。     

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究*

从深海的 3 8份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY A ,其最适生长温度为1 0℃ ,能适应较大范围的pH值和盐度。此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶 ,不利用单一氮源 ,最适产酶条件为 :pH1 0 0 ,1 0℃ ,接种量 0 5 % ,2 0 0r/min摇床培养 48～ 72h。粗酶液的最适作用温度为 40℃ ,最适pH值为 1 0 ,在pH9～ 1 2内稳定 ,是一碱性蛋白酶。     

基因组改组提高干酪乳杆菌耐酸性生产L-乳酸

首先采用紫外线与亚硝基胍两种传统微生物诱变方法对干酪乳杆菌进行诱变,经低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶试验获得了5株耐酸性提高的突变菌株.以获得的突变菌株为出发菌株,应用灭活双亲原生质体融合后致死损伤得到互补获得活性融合子的方法,对其进行基因组改组,经过低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶筛选,获得4株可以在pH3.8平板上旺盛生长且产酸量较高的改组菌株.将改组菌株与原始菌株分别于pH 3.8和3.4的YE液体培养基中培养,改组菌株能够在原始菌株无法生存的pH条件(pH 3.4)下生长.在pH 3.8的条件下,对改组菌株与原始菌株的发酵特征进行比较,37℃发酵48小时后,改组菌株产酸量为原始菌株的2.4倍,表明基因组改组技术能有效提高多基因调控表型的进化.     

一株羽毛降解菌的分离与鉴定

【目的】从土壤中分离并鉴定羽毛降解菌,测定其生长最适温度及起始pH,并观察酶活动态。【方法】采用系列稀释法和选择培养基法筛选目的菌株,基于16S rRNA基因序列及Biolog方法鉴定其分类地位,利用全自动生长曲线分析仪监测菌株的最适生长条件,并通过测定蛋白水解活性观察其酶活动态。【结果】从混合羽毛的土壤样品中筛选到一株羽毛降解菌,命名为菌株GIMN1.015,初步判定该菌株属于芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)。最适生长pH为9.0,温度为30°C。蛋白水解活性最高值出现在培养后96 h。【结论】菌株GIMN1.015在利用羽毛角蛋白资源中具有潜在的应用价值。这是芽孢八叠球菌在羽毛降解方面的首次报道。