基于16S rDNA扩增子测序技术揭示真胃左方变位对奶牛粪便微生物的影响

[目的]本试验旨在测定产后健康奶牛和罹患真胃左方变位(left displacement of the abomasum, LDA)奶牛粪便中微生物菌群的变化,以期探讨LDA发生与菌群的关联性,评估其对机体代谢的潜在影响.[方法]采用16S rDNA高通量测序技术,测定10头健康奶牛(Health)、10头真胃左方变位...     

橡树岭军团菌的分离及用16S rDNA测序法的鉴定

军团菌属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ）自１９７１年确定以来,现已有３９个成员。军团菌属主要分布于供水系统中,如空调冷却塔水和浴池淋浴水中。我们曾于１９９４年从北京某宾馆冷却塔水中分离出一株可疑军团菌,但因缺乏标准抗血清而未能定种。由于核酸分析技术和细菌鉴定观念上进步,使我们能根据１６ＳｒＤＮＡ序列比较推测细菌间进化关系,并进而对未知细菌进行鉴定和检测。我们用以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列的ＰＣＲ和测定鉴定,确定了该分离株为橡树岭军团菌（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｎｓｉｓ）。     

基于16S rDNA测序技术分析功能性便秘患者粪便菌群

运用16S rDNA测序技术分析功能性便秘（FC）患者粪便菌群特征,以期寻找FC特征菌,为FC诊治寻找新的治疗靶点。

收集福建中医药大学附属第二人民医院60例实验组（FC患者）和30例正常组的粪便,采用16S rDNA测序技术分析粪便菌群结构,并进行基因功能的预测。

两组在门水平上,主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成;在属水平上,主要优势菌以粪杆菌属和拟杆菌属为主。实验组粪便菌群丰富度指数Chao1、Observed_OTUs较正常组升高（P＜0.05）,多样性指数Shannon指数和Simpson指数虽有上升趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。布劳特菌属、罗氏菌属、Ruminococcus_gnavus_group、Ruminococcus_gauvreauii_group、Eubacterium_hallii_group、Anaerostipes、Lachnospiraceae_ND3007_group、Dorea、乳球菌属在实验组中丰度均显著降低（P＜0.01）。实验组特征菌为小杆菌属,正常组为布劳特菌属和埃希菌−志贺菌属。实验组蔗糖降解Ⅲ（PWY-621）、丙酮酸发酵成乙酸和乳酸（PWY-5100）和琥珀酸发酵成丁酸盐（PWY-5677）功能下降（P＜0.05）。

功能性便秘患者主要表现为肠道菌群丰度与多样性升高,FC的发病可能与菌群结构发生改变有关。

     

16S rDNA测序研究高脂饮食诱导的高脂血症大鼠肠道菌群变化

通过高脂饮食诱导大鼠高脂血症, 采用16S rDNA测序检测高脂血症大鼠肠道菌群变化情况。

SD大鼠20只(清洁级), 按体质量随机分为模型组和对照组, 对照组大鼠给予维持饲料, 模型组大鼠给予高脂饲料。1周后检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。采集大鼠粪便, 采用16S rDNA测序法对大鼠肠道菌群进行分析, 考察高脂血症大鼠肠道菌群变化情况。

高脂血症大鼠肠道菌群生物多样性(Alpha多样性和Beta多样性)发生显著变化, 肠型与对照组差异明显, 在门、科、属等多个水平差异均具有统计学意义。其中, 厚壁菌门(Firmicutes)和念珠菌门(Candidatus saccharibacteria)数量显著下降, 拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)数量显著升高。

高脂饮食诱导的高脂血症可引起大鼠肠道菌群发生显著变化。

     

16S rRNA测序技术在肠道微生物中的应用研究进展

16S rRNA测序是高通量测序依赖的肠道微生物研究方法之一,该方法可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量,因此正逐渐成为研究肠道微生物菌种丰度变化的主流。肠道微生物16S rRNA测序的应用过程中有两个问题至关重要,一是如何根据需要选择测序方案;二是面对高通量测序得到的海量数据,如何进行生物信息学分析,以得到具有生物学意义的结果。从测序平台、测序片段、测序数据量的选择3个方面讨论了如何选择测序方案,并从序列聚类与注释、群落结构分析、关键分类单位的筛选与功能分析等方面对目前常用的生物信息学分析手段进行综述。     

基于16S rDNA测序绝经综合征抑郁患者肠道菌群结构与功能性分析

目的 通过16S rDNA测序技术对绝经综合征抑郁患者肠道菌群分布、多样性和基因功能进行分析,探讨肠道菌群与绝经综合征抑郁发生的关联。方法 选取2021年6月至2022年3月就诊于我院妇科门诊的绝经综合征抑郁患者19例为观察组（A组）,同期绝经综合征患者10例为对照组（C组）。利用16S r DNA基因测序法对患者肠道菌群进行物种注释分析和功能比较,统计两组肠道菌群分布、多样性和基因功能的变化。结果 两组肠道菌群差异明显。GraPhlAn物种组成图显示,患者肠道菌群总体以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门组成。在门水平,与C组相比,A组放线菌门、变形菌门相对丰度较低,拟杆菌门相对丰度较高。在属水平,与C组相比,A组拟杆菌属、小杆菌属、巨单胞菌属、Lachnospiracea＿incertae＿se相对丰度较高,而Gemmiger、布劳特菌属、普雷沃菌属、粪球菌属、粪杆菌属、双歧杆菌属相对丰度偏低。进一步在属水平上选取了10种相对丰度差异具有统计学意义的菌群（P<0.05）：韦氏球菌属、消化球菌属、巨单胞菌属、史雷克菌属在A组的相对丰度较高（P<0.05）,柯林斯菌属、C...     

16S rRNA基因高通量测序分析水性涂料微生物群落结构及多样性

微生物对水性涂料产品的稳定性起着重要作用,本实验以广东省某涂料厂的水性涂料为研究对象,利用16S rRNA基因高通量测序技术检测其微生物群落结构及多样性。结果表明5个水性涂料样本在97%的相似水平下共获得有效序列总数224 801,涵盖了10门16纲30目46科59属的细菌;物种组成与相对多样性由高到低依次分别为A4、A5、A1、A2和A3;水性涂料样本A1、A2和A3微生物群落结构与聚集规律较为相似,优势菌群均为类芽孢杆菌门、芽胞乳杆菌属和固氮菌;水性涂料样本A5中相对丰度为57.3%的产己酸细菌属于特异菌群。本研究解析了水性涂料中微生物群落结构、相对丰度及多样性,为建立和完善水性涂料中微生物防控体系提供理论支撑。     

细菌性阴道病肠道菌群与阴道菌群16S rDNA测序分析

目的通过对细菌性阴道病(BV)患者肠道菌群及阴道菌群16S rDNA扩增子测序,分析其结构、多样性、相关性以及BV对肠道菌群的影响,为今后治疗BV提供新的思路。方法选取符合纳入标准的BV患者11例(BV组),健康者9例(C组),留存阴道分泌物及新鲜粪便进行16S rDNA基因检测分析。结果C组阴道菌群以乳杆菌属为主,BV与加德纳菌属、普雷沃菌属、Sneathia、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、阿托波菌属、Shuttleworthia、巨型球菌属密切相关。BV组肠道、阴道菌群丰富度均高于C组。Alpha多样性分析中C组和BV组肠道菌群、阴道菌群的Shannon指数组间比较,χ²值为29.137, P=0.000<0.05,两组阴道菌群Shannon指数组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),BV组高于C组。物种多样性曲线反映本研究样本测序数据量的合理性,表明BV组的肠道菌群多样性、丰富度均高于C组,主坐标分析表明C组肠道与阴道的菌群结构差距较大,BV组肠道与阴道的菌群结构有相似之处,且两组肠道菌群结构接近。BV组阴道菌群中厚壁菌门丰度较C组低,放线菌门、拟杆菌门较C组高;BV组肠道菌群中拟杆菌门丰度较C组低;C组肠道中拟杆菌门明显高于阴道,厚壁菌门明显低于阴道; BV组阴道菌群中放线菌门丰度高于C组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论BV阴道菌群与肠道菌群具有相关性,BV可能引起肠道菌群结构比例和多样性的改变。     

16S rDNA高通量测序分析腹膜透析胃肠功能障碍患者肠道菌群特征

采用16S rDNA高通量测序技术分析腹膜透析（PD）胃肠功能障碍患者的肠道菌群变化特征,探讨肠道菌群在腹膜透析胃肠功能障碍中的具体作用。

收集25例PD胃肠功能正常者（PDGF组）、25例PD胃肠功能障碍者（PDGD组）和13例健康者（Normal组）的粪便样本,提取肠道菌群基因组,应用16S rDNA高通量测序技术对各组测序结果进行菌群多样性、物种组成差异和菌群功能分析。

3组的Observed species指数（H = 6.905,P = 0.032）和Shannon指数（H = 6.993,P = 0.030）差异具有统计学意义。与Normal组相比,PDGD组Shannon指数显著降低（P = 0.027）,PDGF组Observed species指数显著升高（P = 0.044）;与PDGF组相比,PDGD组Observed species和Shannon指数显著降低（P＜0.05）。PCoA结果显示3组各自聚集,区分较明显。UPGMA聚类分析结果显示3组大部分样本均在本组中聚类后再与其他组进一步合并。LEfSe分析结果显示,Normal组优势菌群包括颤螺菌目（Oscillospirales）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）等;PDGF组优势菌群包括毛螺菌目（Lachnospirales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、布劳特菌属（Blautia）;PDGD组优势菌群包括芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌属（Streptococcus）、链球菌科（Streptococcaceae）等。KEGG L1水平的功能组成集中在代谢、遗传信息处理和环境信息处理;KEGG L2水平的功能主要集中在碳水化合物、氨基酸代谢、遗传信息的复制和修复及转运、膜运输途径;与Normal组和PDGF组相比,PDGD组在碳水化合物、氨基酸代谢途径富集减少,感染性疾病、聚糖生物合成和代谢途径富集增加。

PD胃肠功能障碍患者存在肠道菌群失调,调整肠道微生态是防治PD患者出现胃肠功能障碍的潜在干预靶标。

     

基于16S rDNA基因的谷斑皮蠹PCR检测技术

【目的】谷斑皮蠹是一种重要的检疫性害虫,在新疆周边多个国家分布,口岸检疫人员多次从进境货物中截获谷斑皮蠹,该虫对新疆的农业生产极具威胁。【方法】以谷斑皮蠹的16S rDNA基因为靶序列,用昆虫通用引物对4种供试皮蠹进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,用生物软件设计检测谷斑皮蠹的特异性引物与探针。【结果】设计的特异性引物(TG-SNP-F/TG-SNP-R)及所建立的常规PCR方法能有效检测出谷斑皮蠹,其扩增产物的片段大小为250 bp,灵敏度为3 ng·μL~(-1)。设计的特异性引物(TG-F/TG-R)和探针(TG-probe),以及所建立的实时荧光PCR方法,对谷斑皮蠹的检测特异性强,灵敏度达0.8 fg·μL~(-1)。【结论】建立的常规PCR方法和实时荧光PCR检测方法能够对谷斑皮蠹进行准确鉴定,为口岸检疫人员检测进境货物中携带的谷斑皮蠹提供技术支持。     

16S rDNA克隆文库法探索转基因香石竹对土壤细菌群落的影响

【目的】通过研究转基因香石竹对土壤细菌群落的影响,为转基因香石竹的环境安全性评价提供依据。【方法】通过构建16S rDNA克隆文库,分析种植转基因和非转基因香石竹的土壤中细菌的群落结构组成。【结果】转基因和非转基因香石竹土壤中,共有的菌群有变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria),其中α-变形菌门、β-变形菌门、浮霉菌门为优势菌群;而在放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)及未培养菌(Uncultured bacterium clone)等菌群存在部分差异。【结论】通过16S rDNA克隆文库方法揭示了转基因香石竹的土壤中细菌多样性十分丰富,其栽培对土壤细菌群落结构影响有限。     

基于16S rRNA基因测序分析微生物群落多样性

微生物群落多样性的研究对于挖掘微生物资源,探索微生物群落功能,阐明微生物群落与生境间的关系具有重要意义。随着宏基因组概念的提出以及测序技术的快速发展,16S rRNA基因测序在微生物群落多样性的研究中已被广泛应用。文中系统地介绍了16S rRNA基因测序分析流程中的四个重要环节,包括测序平台与扩增区的选择、测序数据预处理以及多样性分析方法,就其面临的问题与挑战进行了探讨并对未来的研究方向进行了展望,以期为微生物群落多样性相关研究提供参考。     

基于16S rDNA的系统发育分析在微生物进化关系中的应用

系统发育树的构建是现代生命科学研究中的重要技术,是分析未知菌种与其他菌种的亲缘关系,为进一步了解生物的进化关系的重要依据。对系统发育树的构建进行了详细的介绍。并对其在微生物进化研究中的具体应用进行了阐述。     

基于16S rDNA序列的Wolbachia的检测及分型

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生细菌。采用16S rDNA特异片段的PCR-RFLP方法对烟粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）不同生物型及米蛾Corcyra cephalonica （Stainton）共生菌Wolbachia进行了检测与分型分析。基于wsp基因对烟粉虱共生菌B组Wolbachia以及米蛾共生菌Wolbachia进行了系统树分析,并对相应的Wolbachia16S rDNA特异片段进行了克隆、测序以及序列比对。结果表明:16S rDNA的特异片段经NheⅠ酶切后RFLP图谱可有效检测与鉴别Wolbachia。烟粉虱共生菌Wolbachia的16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切后可得到预期RFLP图谱,而米蛾共生菌B组Wolbachia （基于wsp序列分析为B组）则产生不同的RFLP图谱。序列分析表明,Nauru型烟粉虱体内B组Wolbachia的16S rDNA片段序列与已知B组Wolbachia对应序列（DQ278884）同源性为100%;米蛾体内B组Wolbachia 16S rDNA特异片段有碱基变异,并存在于VspⅠ识别位点内,这是导致VspⅠ酶切后RFLP图谱不同的原因。结果提示,B组Wolbachia 16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切的RFLP图谱存在多态性。本研究结果可为今后Wolbachia的检测与分型提供借鉴。     

基于16S rDNA测序对茶园土壤细菌群落多样性的研究

土壤细菌群落组成和多样性,对茶园土壤生态系统健康和肥力可持续性具有的重要理论意义。利用Illumina高通量测序技术测定分析16S rDNA,研究云南景迈山、布朗山和南糯山的现代茶园、古茶园(林)和森林土壤的细菌群落结构与多样性。结果表明:古茶园土壤细菌的丰度和多样性高于现代茶园及森林;研究土壤样本细菌共分属47个菌门、89个目,其中变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门与拟杆菌门是优势类群,它们在森林、现代茶园和古茶园土壤中的相对丰度累计分别达91.86%、82.48%和77.08%;伯克霍尔德氏菌目、根瘤菌目是优势菌群,其平均丰度分别达13.91%和8.17%,黄单胞菌目、红螺菌目、芽孢杆菌目、放线菌目和拟杆菌目等12个目的丰度较高,达2%以上;PCA分析表明:森林、现代茶园和古茶园土壤的细菌群落结构差异明显,除景迈山外,主要优势细菌丰度依次为:古茶园现代茶园森林,古茶园土壤细菌多样性有增强趋势。     

木蓝根瘤菌的16S rDNA全序列分析及DNA-DNA杂交

通过数值分类、ＳＤＳ－全细胞蛋白电泳分析,对分离自西北黄土高原地区的木蓝根瘤菌进行了研究,获得了１个新类群。在此基础上,进行了中心菌株ＳＨＬ０４２的１６Ｓ ｒＤＮＡ全序列分析,得到系统发育树状图。 ＳＨＬ０４２与 Ｒ.ｔｒｏｐｉｃｉ Ａ、 Ｒ.ｔｒｏｐｉｃｉ Ｂ、 Ｒ.ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、 Ｒ ｅｔｌｉ、 Ｒｈａｎａｎｅｓｉｓ、Ｒ. ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ和Ｒ.ｇａｌｌｉｃｕｍ构成一个发育分支,其与这些种模式菌株 １６Ｓ　ｒＤＮＡ全序列的相似性分别为９５．４％、９５．５％、９６．３％、９５．８％、９６．３％、９７．９％和９７．７％,均大于９５％,应属于同一个属。新类群群内ＤＮＡ同源性大于８０％,而中心菌株ＳＨＬ０４２与分支内各已知种的ＤＮＡ同源性小于５０％,表明ＳＨＬ０４２代表１个新的根瘤菌菌种。     

基于16S rRNA高通量测序技术分析安格斯牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

本研究旨在系统探索和分析安格斯牛瘤胃微生物多样性及其基因功能。选用体重550 kg左右的安格斯牛6头分成2组,利用基于16S rRNA高通量测序技术检测牛瘤胃液样本进行组学分析。结果表明,2组样本通过Illumina Miseq测序平台共获得86 298条高质量优质序列,聚类为346个操作分类单元(OUT),经分类学鉴定分属13个门,21个纲,24个目,40个科,123个属。拟杆菌门(Bacteroidetes)43.16%和厚壁菌门(Firmicutes)36.29%为优势菌群。基于属的组成,依次为普雷沃氏菌属_7 (Prevotella_7) 29.28%、琥珀酸弧菌科_UCG-001 (Succinivibrionaceae_UCG-001)11.30%、琥珀酸菌属(Succiniclasticum) 11.10%、普雷沃氏菌属_1 (Prevotella_1) 6.65%、瘤胃球菌属_1(Ruminococcus_1) 5.17%、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio) 2.75%等。16S功能预测和COG、KEGG代谢通路数据库对比发现,功能集中在氨基酸运输和代谢、碳水化合物转运及代谢的相关基因上,可能含有丰富的蛋白分解、转运及代谢酶相关基因和大量的纤维素以及木质素降解酶基因。经碳水化合物活性酶(CAZymes)注释和KEGG代谢酶数据库比对显示,预测的功能基因糖苷水解酶和糖基转移酶所占比例较高;产乙酸和丁酸相关酶基因丰度较高。安格斯牛瘤胃内含有丰富的蛋白质分解、木质纤维素降解和挥发性脂肪酸生成菌群及酶系,为展示瘤胃微生物多样性,发现和筛选新的功能酶基因提供参考。     

基于16S rDNA基因序列的泽兰实蝇幼虫肠道细菌多样性分析

【目的】探究泽兰实蝇 Procecidochares utilis 幼虫肠道细菌的多样性。【方法】利用Illumina HiSeq技术对泽兰实蝇幼虫肠道细菌的16S rDNA-V6变异区序列进行测序,应用USEARCH和QIIME等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）数量,分析物种的丰度和Alpha多样性。【结果】共获得1 593 506 对reads,拼接为1 579 372条tags,经过滤后得到的1 572 860条tags聚类为1 341个OTU。总共注释到13个门,4个纲,6个目,7个科,10个属和4个种。其中变形菌门(Proteobacteria)的细菌为优势菌,占99%;在属分类阶元上,沃尔巴克氏体属 Wolbachia 占45%,是优势属。【结论】泽兰实蝇幼虫肠道细菌多样性丰富。相关的种类和丰度信息为后期研究揭示肠道细菌介导泽兰实蝇寄主植物专化性奠定了基础。     

甘草根瘤菌的16S rDNA全序列测定及系统进化分析

通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究,发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对其中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035进行16S rDNA全序列测定及系统进化研究。结果表明,CCNWGX022和CCNWGX035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16S rDNA相似性分别大于96．8％和98．3％,因此它们均属于中慢生根瘤菌属。     

应用16S rDNA克隆文库法分析有机物料腐熟菌剂细菌组成

应用16SrDNA克隆文库法对有机物料腐熟菌剂A和B样品中的细菌组成进行分析研究。结果表明,样品A有14个OTU,主要是融合乳杆菌(Weissella confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),其比例分别占总克隆文库的28.6%、30.4%和23.2%;样品B有43个OTU,主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),占总克隆文库的比例分别为18.03%、18.86%和13.12%;所得出的结果均与产品标注存在差异,样品A未提及细菌的种类,而样品B只标注短小芽孢杆菌。研究表明这一方法在微生物菌剂细菌组成分析及其质量检测中具有良好的应用前景。