PAI—2及其突变体的生物化学性质

为研究和比较纤深酶原激活剂抑制物２型（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ ２,ＰＡＩ－２）及其突变体的生物化学性质,用ＰＣＲ、体外定点突变技术构建ＰＡＩ－２突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ,将突变体ｃＤＮＡ与原核表达载体重组并转化怕杆菌。经诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实表达出相应蛋白质,均占全菌总蛋白的１４％。Ｗｅｔｅｒｎ印迹、溶圈抑制及纤维蛋白翻转板     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

PAI—2抑制细胞凋亡依赖其蛋白质结合功能域

将纤深酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３重组,构建真核表达质粒并转染ＨｅＬａ细胞,经Ｇ４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ迷鉴定和ＥＬＩＳＡ检测,筛选出稳定表达ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２Ｑ的阳性细胞株。ＥＬＩＳＡ结果表明ＰＡＩ－２突变蛋白质在转染细胞中的表达量与相应野生型ＰＡＩ－２在阳性细胞克隆中的表达量基本相近,ＰＡＩ－２及其突变体在理     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。     

亲和层析纯化HepG_2细胞分泌的PAI－1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性６．１×１０４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡＩ－１活性。用ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析进一步纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯的糖基化ＰＡＩ－１。     

亲和层析纯化HepG2细胞分泌的PAI—1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性为６．１×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡ     

凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究

用Ｋｕｎｋｅｌ突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｓｃｕ－ＰＡ）ｃＤＮＡ基因中编码Ｐｒｏ１５５—Ｌｙｓ１５８的片段定点突变,并将此突变的ｓｃｕ－ＰＡ（ｔｓｃｕ－ＰＡ）的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞．获得的稳定表达株在无血清培养基中２４ｈ的表达量为６２０ＩＵ／１０６细胞．经锌离子螯合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析得到ｔｓｃｕ－ＰＡ纯品．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示ｔｓｃｕ－ＰＡ分子量为５３ｋＤ左右,与预期的结果相符．ｔｓｃｕ－ＰＡ是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子（ｔｃｕ－ＰＡ）．ｔｓｃｕ－ＰＡ仍保持了ｓｃｕ－ＰＡ的血纤维蛋白亲和性．酶动力学研究表明,激活后的ｔｓｃｕ－ＰＡ水解Ｓ２４４４的Ｋｍ和Ｋｃａｔ值与高分子量尿激酶（ＨＵＫ）相似．体外溶栓实验结果表明,ｔｓｃｕ－ＰＡ可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定

将编码３７９个氨基酸残基的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和ＰＨＯ１分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒ｐＹＩＳ－１．表达质粒转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇营养型酵母细胞,筛选Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ－表型的转化子,经低密度摇瓶培养,１％甲醇诱导表达７ｄ后,培液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,ＰＡＩ－１生物活性测定和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达出分子量为４３～５１ｋＤ的４条ＰＡＩ－１条带．表达的ＰＡＩ－１能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的２６％左右,达４ｍｇ／Ｌ培液;其比活性为１．１６×１０４ＡＵ／ｍｇ．不同分子量ＰＡＩ－１可能与其糖基化程度不同有关     

人微小纤溶酶基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增人微小纤溶酶原（Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎｇｅｎ,ｍＰｌｇ）基因,再与表达戴本重组,构造ｍＰｌｇ原核表达质粒并转化大肠杆菌,阳性克隆ｐＳＳＥ－ｍＰｌｇ经温度诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等方法证明表达产物的分子量约为２９ｋＤａ占全菌总蛋白的２４％左右,并在菌内形成包涵体,经半胱氨酸再氧化法和空气氧化法复法,表达产物的ｒ－ｍＰｌｇ经ＳＫ作用后显示纤溶活性。同时对蛋白质浓度,复性时间等因素对     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

ATF-PAI2CD融合蛋白的生物学功能

为了解尿激酶型纤溶酶激活物 (urokinase typeplaminogenactivator,uPA)的氨基末端片段 (amino terminalfrag ment,ATF)和纤溶酶激活物抑制剂 2 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )突变体PAI 2CD融合蛋白在大肠杆菌的表达情况及进一步研究其生物学活性、将ATF PAI2CD融合基因与大肠杆菌表达载体pLY 4重组得到表达质粒pZWE ATF PAI2CD ,以其转化大肠杆菌JF112 5 ,经温度诱导 ,ATF PAI2CD获得较高水平表达 ,融合蛋白质以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 15 %。包涵体经洗涤、8mol L尿素溶解、稀释复性及离子交换色谱一步分离 ,纯度达 90 % ,分子量与理论值相符。每升发酵液得重组融合蛋白质 5 0mg。经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 ,比活性达 12 0 0 0IU mg ;应用放射竞争法证实融合蛋白质能与肿瘤细胞表面的uPA受体特异性结合。双功能融合蛋白质的纤溶抑制活性与野生型PAI 2 (或PAI 2突变体 ,PAI 2CD)基本一致 ,与肿瘤细胞表面的uPA受体的结合能力同pro uPA。     

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

拟南芥VSP2蛋白的重组表达及其酸性磷酸酶活性的测定

通过PCR扩增从拟南芥cDNA文库中得到VSP2蛋白的编码序列,将其构建到原核表达载体pET-22b上,并在大肠杆菌BL21菌株中实现高效可溶表达。经过Ni-NTA亲和层析一步纯化,获得电泳纯的重组VSP2蛋白。以pNPP为底物检测,该蛋白具有酸性磷酸酶活性,反应的最适pH值4.5,最适温度为45oC,Km值为26.2mM。重组VSP2蛋白表达量高,纯化后均一性好,适于蛋白晶体生长。     

Cloning and high-level expression of plasminogen activator inhibitor-1 cDNA derived from human glomerular mesangial cells

Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ1(ＰＡＩ1)ｉｓａｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｕｒｏｋｉｎａｓｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ(ｕＰＡ)ａｎｄｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ(ｔＰＡ)[1].ＣｈａｎｇｅｓｏｆＰＡＩ1ｍａｙｉｎｄｕｃｅｉｍｂａｌａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ(ＥＣＭ)ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ,ｔｈｕｓｌｅａｄｉｎｇ…     

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .     

壳聚糖酶的克隆表达与壳寡糖的制备分析

目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

人角质化细胞生长因子-2基因的克隆、表达及产物的纯化、鉴定

用高表达菌株BL21codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子(Hkgf-2)蛋白并初步纯化和检测其活性。通过RTPCR从流产胎儿肺组织中钓取hKGF-2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21codon plus compent cells中表达hKGF-2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。结果显示,hKGF-2蛋白在BL21中得到高效表达;hKGF-2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性。