分枝杆菌脂聚糖的分离、纯化及其结构和功能分析

【目的】建立分离、纯化分枝杆菌脂聚糖的方法,初步比较分析不同菌株来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)的结构差异及研究脂聚糖刺激对巨噬细胞环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达的影响。【方法】应用Triton X-114液相法提取脂聚糖,电洗脱法分离纯化,基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行分子量鉴定;基于特异性识别非还原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新诺分枝杆菌JDM601、结核分枝杆菌H37Rv标准株和耻垢分枝杆菌mc2155脂聚糖的结构差异;进一步用Western blot检测脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结果】通过电洗脱法成功纯化出3种菌株脂聚糖;MALDI-TOF/TOF-MS鉴定发现,分子量从小到大依次为新诺分枝杆菌JDM601、耻垢分枝杆菌mc2155和结核分枝杆菌H37Rv来源的脂聚糖。Western blot显示,Con A能与结核分枝杆菌H37Rv标准株来源的LAM相互作用,而不能与新诺分枝杆菌JDM601和耻垢分枝杆菌来源的LAM相互作用;并且发现Con A与新诺分枝杆菌JDM601来源的LM有很强的反应,然而与其余两种来源的LM反应很弱。3种菌株来源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结论】首次成功对来源于中国临床分枝杆菌分离株的脂聚糖进行了分离纯化,初步探讨了不同菌株来源分枝杆菌脂聚糖的结构差异,并表明LAM和LM均能刺激巨噬细胞诱导COX-2蛋白的表达,为进一步研究其对宿主的毒力和免疫机制奠定了基础。     

酿酒酵母酚类抑制物耐受性脂质组学研究

通过脂质组学分析方法从细胞膜磷脂分布方面探究适应进化酿酒酵母酚酸耐受性机制。主要利用高效液相色谱-质谱(LC-MS)对酚酸胁迫下适应进化菌株和原始菌株脂质成分检测并进行统计学比较分析。检测出565种脂质代谢物,包含细胞膜磷脂185种。相比初始菌株,适应进化菌株细胞膜中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)类磷脂分子相对含量增加,含有长链(C32-C36)和双不饱和脂酰链的磷脂分子含量增加。统计学分析表明显著性差异磷脂分子主要为含有长链不饱和脂酰链的PC和PE类磷脂分子。推测适应进化菌株通过膜磷脂重塑提高细胞膜完整性,对酚类抑制物起到选择性屏障作用,从而保持细胞活性。     

植物多糖抗肿瘤作用与机理研究——Ⅲ、茯苓多糖(PPS)和刺五加多糖(ASPS)对S180细胞膜脂肪酸组成的影响

我们先前的研究表明,植物多糖抑制体外培养的小鼠肉瘤S180细胞增殖并使细胞膜磷脂含量减少,同时抑制膜磷脂酰肌醇转换。为进一步探讨植物多糖与膜磷脂的关系,本文采用毛细管柱气相色谱法分析了茯苓多糖(PPS)、刺五加多糖(ASPS)与S180细胞一同温育24h后,细胞膜磷脂和中性脂的脂肪酸组成变化,发现中性脂的脂肪酸组成和不饱和性不受影响,磷脂的脂肪酸组成发生明显改变,花生四烯酸(C(20:4))和豆蔻酸(C(14:0))降低(P<0.05或P<0.01),与用作阳性药物对照的氨甲喋呤作用相似。本文对膜磷脂脂肪酸组成变化的意义结合先前的实验结果进行了讨论,认为在PPS、ASPS的抗肿瘤机理中,细胞膜磷脂生化特性的改变是重要环节。     

儿茶素诱导的拟南芥根细胞膜脂变化

儿茶素是一种可以短时间内杀死植物细胞的植物毒素,由于具有强的植物毒性,儿茶素是开发除草剂的理想化合物,它可以诱导植物根系统的死亡.为了研究植物根细胞膜脂对化学胁迫的响应规律,我们运用高通量的脂类组学方法检测了拟南芥根中膜脂分子的组成,比较了儿茶素处理下拟南芥野生型(WS)及磷脂酶Dδ缺失突变体( PLDδ-KO)根中膜脂分子的组成情况、膜脂含量、双键指数及碳链长度值.结果发现,儿茶素处理拟南芥根90 min后,二半乳糖基二酰甘油(DGDG)、单半乳糖基二酰甘油(MGDG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰肌醇(PI)的总含量在WS与PLDδ-KO植株根中都显著下降,磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)在WS中下降,在PLDδ-KO中上升.儿茶素处理导致PLDδ-KO植株的PC/PE比值显著下降,WS植株PS碳链长度显著增加.上述结果说明儿茶素处理后,磷脂酶Dδ缺失突变体膜不稳定性增加,PLDδ-KO植株对儿茶素胁迫更加敏感.     

磷脂酰肌醇二磷酸

磷脂酰肌醇 4,5二磷酸 (ｐｈｏｓ ｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ(4,5 ) ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ,ＰＩＰ2 )仅占膜磷脂的不到 1 % ,功能却非常复杂。这种低丰度的多磷酸肌醇脂 (ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏ ｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ)可被激素或细胞因子受体介导活化的磷酸脂酶Ｃ(ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ ,ＰＬＣ)水解为第二信使分子肌醇三磷酸 (ＩＰ3)和二酰基甘油 (ＤＡＧ)参与信号传递。最近的研究表明细胞表面 ,即质膜 ,是ＰＩＰ2 功能表现的主要场所 ,参与了细胞膜上许多重要生理过程 ,如膜转运、膜与细胞骨架之间的相互作用及其与…     

探索大肠杆菌细胞膜合成过程中脂肪酸的掺入模式

【目的】探索大肠杆菌生长分裂过程中,脂肪酸作为底物在细胞膜合成过程中的掺入模式。【方法】本研究解析了以乙酰CoA为底物,合成中间产物长链脂酰-ACP,随后合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)的途径,并将合成途径中的10个关键酶与绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)或红色荧光蛋白(monmer Cherry,mCherry)进行融合,在大肠杆菌内表达这些融合蛋白,用激光共聚焦荧光显微镜成像的方式来获得这些融合蛋白的定位信息。【结果】宽场荧光显微镜成像结果显示,磷脂酰乙醇胺合成途径中的10个酶在不同表达水平下出现不同的定位模式。在大肠杆菌中高水平表达融合蛋白EGFP-FabA、EGFP-FabB、EGFP-FabI、EGFP-FabG、EGFP-PlsB和EGFP-PssA时,细胞两极和中部有大量蛋白聚集的现象。EGFP-FabD、EGFP-FabF、EGFP-CdsA、EGFP-PSD在不同表达水平下,均匀分散在细胞质或细胞膜上。缩时影像(Time-lapse)结果显示,合成途径中的一个关键蛋白EGFP-Pls B在细胞分裂前随着细胞膜的内陷聚集到细胞隔膜,随着细胞分裂,母细胞的隔膜成为新细胞的两极。【结论】本研究通过获取磷脂酰乙醇胺合成相关蛋白酶在大肠杆菌中的定位结果,推测脂肪酸分子是在细胞分裂隔膜和两极掺入,被催化合成PE后被运送到细胞膜其他位置。     

植物多糖抗肿瘤作用与机理研究：Ⅲ,茯苓多糖（PPS）和刺五加多糖（A…

我们先前的研究表明,植物多糖抑制体外培养的小鼠肉瘤Ｓ１８０细胞增殖并使细胞膜磷脂含量减少,同时抑制膜磷脂酰肌醇转换。为进一步探讨植物多糖与膜磷脂的关系,本文采用毛细管柱气相色谱法分析了茯苓多糖（ＰＰＳ）、刺五加多糖（ＡＳＰＳ）与Ｓ１８０细胞一同温育２４ｈ后,细胞膜磷脂和中性脂的脂肪酸组成变化,发现中性脂的脂肪酸组成和不饱和性不受影响,磷脂的脂肪酸组成发生明显改变,花生四烯酸（Ｃ２０：４）和豆蔻酸（     

一个新发现的第二信使——肌醇磷脂

环核苷酸作为由细胞膜向细胞内传递信息的第二信使已为人们所熟知。最近又发现了一个新的第二信使——肌醇磷脂(inositol phospholipids),这一研究正在迅速开展。肌醇磷脂是存在于细胞膜上的多种磷脂之一,由甘油磷脂与肌醇结合而成。在肌醇磷脂激酶和ATP的作用下,在肌醇的第4、5位上磷酸化,成为4,5二磷酸肌醇磷脂(phosphoinositol 4,5-diphosphate,PIP_2),这是第二信使的前体。当细胞膜上某些受体(如脑内的乙酰胆碱受体,肾上腺皮质细胞上的血管紧张素受体,血小板上的ADP受体等)受刺激发生构型变化时,存在于细胞膜内的磷脂酶C即被活化,而使PIP_2发生水解,生成二酰基甘油(diacylglycerol,DG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP_3)。     

磷脂酰肌醇 -3 激酶不直接调控PC12 细胞的分泌

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是磷脂酰肌醇代谢过程中一种重要的酶,通过其代谢产物参与了对多种细胞生理活动的调节,如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活、吞噬作用、细胞凋亡等.为研究其对细胞分泌功能的作用,使用磷脂酰肌醇-3激酶家族的特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)阻断磷脂酰肌醇-3激酶的活性,以EGFP-2xFYVE融合蛋白与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的结合为指征,使用荧光显微成像技术检测渥曼青霉素对磷脂酰肌醇-3激酶的抑制作用,采用膜片钳膜电容测量方法及光解钙离子释放技术检测渥曼青霉素对PC12细胞分泌功能的影响.实验结果表明,wortmannin阻断了磷脂酰肌醇-3激酶的活性,抑制了磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的产生,并使FYVE与PtdIns-3-P解离,但渥曼青霉素处理之前和处理30 min后的PC12细胞分泌反应的幅度、动力学特性和分泌的钙依赖性均无显著差异,表明磷脂酰肌醇-3激酶对PC12细胞的分泌无显著的直接影响.     

干旱条件下冬小麦幼苗根细胞膜脂组成的变化

干旱条件下小麦幼苗根膜脂总脂肪酸含量、磷脂含量及总脂肪酸双键指数均下降,而游离甾醇含量却明显增加,结果导致游离甾醇／磷脂比率上升。用薄层层析法测得小麦根细胞磷脂主要由磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)及磷脂酸(PA)组成。干旱降低了各种磷脂的含量,但不改变其相对配比。文中讨论了膜脂代谢变化与植物抗旱性的关系。     

结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及活性初步鉴定

目的:提取纯化结核分枝杆菌(MTB)脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。方法:MTB菌体彻底破碎后,去脂,去蛋白,上清液经苯酚萃取,酒精沉淀,得到LAM;以提取的LAM作为包被抗原检测血清中的LAM抗体。结果和结论:提取到LAM抗原,免疫印迹表明,LAM迁移范围相对分子质量为25×103~40×103,主要集中在35×103处。在64例肺结核患者中,有43例LAM-ELISA检测阳性(敏感性为67.19%);在67例健康志愿者中,有64例LAM-ELISA检测阴性(特异性为95.52%)。     

结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖尿检用于儿童结核病诊断的研究进展

结核病(tuberculosis, TB),特别是儿童结核病,仍是影响全球健康的重要因素。由于传统的结核病诊断技术灵敏度、特异度较差,结核病病例常因为无法得到准确、及时的诊断而被延误治疗。儿童结核病病灶含菌量低,且患儿常无法咳出痰,因此,儿童结核病诊断较成人结核病诊断更具有挑战性。脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)细胞壁上的特异性抗原,可以在结核患者的尿液标本中检测到,尿LAM检测有助于快速、准确地诊断结核病。本综述旨在总结LAM检测用于儿童结核病诊断的研究进展。     

GPC3的结构和功能及其在肝细胞癌诊治中的应用

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的一员,它主要通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定在细胞膜外侧。在正常人的肝细胞、良性肝肿瘤和其他成熟体细胞表面几乎不能检测到它的存在,而在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)呈现高表达。因此,GPC3可以作为标志物用以诊断HCC。此外,GPC3在血清和肝组织中过量表达的HCC病人往往预后较差。研究发现,GPC3主要通过激活经典的Wnt信号通路和其他一些通路来促进HCC的迁移和增殖。针对GPC3靶点的单克隆抗体、抗体偶联药物和对应的细胞疗法,可能成为临床治疗HCC的有力武器。     

分枝杆菌膜蛋白相关抗结核药物靶标的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病。当前结核病耐药等问题愈加严重,基于新靶点的抗结核新药研发也变得尤为重要。分枝杆菌膜蛋白是镶嵌于细胞膜磷脂双层或与脂双层结合的一类蛋白,参与细胞结构合成、物质跨膜转运、催化等重要的生物学功能,并在宿主感染中参与免疫识别、免疫逃逸、毒力因子释放等致病机制。另一方面,膜蛋白具有特定的拓扑结构和细胞定位,药物靶标可及性强,因此膜蛋白是抗结核药物作用的理想靶标。本文就分枝杆菌膜蛋白在细胞壁合成、物质跨膜转运、细菌休眠、细菌与宿主互作及分泌系统相关研究进展进行综述,旨在为抗结核药物研发提供新思路。     

高效薄层色谱测定湛江等鞭金藻培养过程脂质变化

【目的】研究湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)由氮元素丰富至限制培养过程中脂质成分的变化。【方法】利用高效薄层色谱(HPTLC)分离分析微藻中脂质。【结果】随着培养基中营养物质的消耗,细胞逐渐处于胁迫状态,在这种状态下,细胞大量积累贮存脂质—甘油三脂(TAG),组成生物膜系统的单半乳糖甘油二脂(MGDG)、硫代异鼠李糖甘油二脂(SQDG)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰胆碱(PC)含量降低,而游离脂肪酸(FFA)、甘油二脂(DAG)、双半乳糖甘油二脂(DGDG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)则相对稳定。【结论】HPTLC可作为一种简便、可靠的微藻中脂质分离分析方法,为研究微藻油脂代谢途径以及甘油三脂(TAG)的调控积累提供有效手段。     

克隆了夜间发作性肌红蛋白尿(PNH)病的一种基因

大阪大学微生物病研究所疑难病生物分析部门免疫不全疾患研究领域的宫田敏男等和名古屋大学、岐阜大学研究组克隆了将与膜蛋白系留到细胞膜上的有关的磷脂酰肌醇(GPI)基因。通物GPI 细胞膜结合的蛋白有补体控制因子DAF 和CD_(59),以及小鼠的膜抗原Thy-1等。得知在PNH的患者中缺损GPI 结合的膜蛋白。这是由于GPI 合成过程的异常本来系留到膜上的蛋白向细胞外分泌。     

气相色谱法检测大鼠脑及颌下腺磷脂酰肌醇代谢环路中肌醇的含量

磷脂酰肌醇(PI)约占细胞总磷脂的5～10％,其代谢十分活跃。近几年来,人们发现PI代谢是许多膜受体信号跨膜转导的重要途径。乙酰胆碱等多种神经递质激动其受体后,经三磷酸鸟苷结合蛋白转导激活细胞膜磷脂酶C,催化PI水解生成两种信使物质:1,4,5一三磷酸肌醇(IP_3)及二酰基甘油,其中IP_3经特异性     

细胞膜相联钙结合蛋白的结构和功能研究进展

细胞膜相联钙结合蛋白(PCaP)是定位于细胞膜上的一类新的Ca2+结合蛋白。简要综述了PCaP的蛋白结构、调控Ca2+/磷脂酰肌醇3-磷酸信号通路的分子机制、调节微管微丝稳定的能力,以及其在植物顶端生长极性中的功能研究进展。     

结核分枝杆菌毒力的研究进展

结核分枝杆菌可以在人体内缓慢增殖,释放代谢产物,造成细胞损伤,引起结核病。其致病机制可能与其复杂的细胞壁成分密切相关。结核分枝杆菌细胞壁中的脂质、糖类及蛋白类物质在构成屏障结构,保护并辅助结核分枝杆菌在细胞内的生长及迁移,调节宿主免疫应答,造成宿主组织细胞损伤等方面发挥重要生物学作用。其表达受众多基因的精细调控。本文将对结核分枝杆菌细胞壁中的脂质阿拉伯甘露聚糖和分枝菌酸在其毒力中的作用,以及sig基因对毒力的调节作用作一综述。     

我国健康成人红细胞膜脂类的脂酸组成

 本文采用双向簿层层析分离红细胞膜脂类,继以毛细管气相色谱法分析其脂酸含量,检测了15名我国健康成人红细胞膜脂类的脂酸摩尔百分组成。结果表明:各脂类中,脂酸的类别基本相同,但其含量组成相差甚远。如磷脂酰乙醇胺(PE)富含C_(20:4);磷脂酰胆碱(PC)富含C_(18:2);神经鞘磷脂(SM)主要含C_(16:0);磷脂酰丝氨酸(PS)主要含C_(18:0);而以红细胞糖苷脂(GL)中脂酸含量最少。膜总脂中饱和脂酸与不饱和脂酸的含量大致相等,胆碱磷脂(PC+SM)的脂酸饱和度则明显高于氨基磷脂(PE+PS)。