免疫纳米荧光微粒的制备和在中药研究中的应用

目的:制备免疫纳米荧光微球(Immunologic Nano-Fluorescence beads,INFB)并对其粒径和功能进行了研究.方法:应用纳米生物技术、免疫学技术和现代细胞生物学研究技术进行研究.选用K562细胞和Hela细胞为靶细胞,经INFB作用48 h后,MTT法检测各组OD值.选用苏木、大血藤、秦巴西菇水提液和茶多糖诱导脐血单个核细胞,用INFB标记,FACS检测结果.结果:扫描电镜显示,荧光微球粒径平均为136.9nm.MTT结果显示,各实验组数据与对照组比较,无统计学意义(p＞0.5),表明INFB对所选靶细胞无生物毒性作用.中药有效成分诱导人脐血单个核细胞后,CD34、CD33、CD14、CD119、CD19、CD4阳性细胞的数值,呈现剂量依赖关系,经统计学分析,药物浓度与检测的靶细胞数量呈现良好的线性关系(r=0.745376～0.986402).结论:INFB可用于医学检验学、免疫学标记和中药活性成分的靶向作用研究等领域.     

基于磁性纳米微球的γ干扰素酶联免疫检测方法建立

目的:建立及评价使用磁性纳米微球作为固相载体的人γ干扰素(Interferon-gamma,IFN-γ)双抗体夹心酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。方法:以杂化细乳液合成法制备磁性纳米微球,将其作为免疫检测的固相载体。将磁性微球与IFN-γ抗体进行偶联,建立基于磁性微球的ELISA检测方法,检测人IFN-γ,绘制IFN-γ标准曲线并进行方法学评价。结果:获得包被有人IFN-γ抗体的免疫微球,抗体偶联率为54.5%。用它建立IFN-γ的双抗体夹心的ELISA检测方法,检测范围为0-1000 pg/m L,相关系数为0.9996,灵敏度23.2 pg/m L,功能灵敏度0 pg/m L,批内和批间变异系数(Coefficients of Variance,CVs)8%,检测总共需要2小时。结论:成功制备了IFN-γ免疫微球并建立了定量检测人IFN-γ的双抗体夹心磁珠酶联免疫方法。     

AlphaLISA技术的发展及应用

AlphaLISA技术是一种基于微珠的化学发光的新型均相检测技术,与传统的ELISA技术相比具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围,而且无需洗涤及样本需求量极少等特点.该技术可用于多种组织、细胞来源的生物分子的检测,如细胞因子、抗原抗体的检测、蛋白相互作用及蛋白质与核酸相互作用的检测以及药物分析等研究.随着AlphaLISA技术的发展,该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用.     

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

目的:利用AlphaLISA技术,建立新型均相检测方法,对金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)进行检测。方法:采用2种SEE抗体建立AlphaLISA检测方法,羊抗肠毒多克隆抗体同受体微球偶联,SEE小鼠单克隆抗体标记生物素,并同偶联了亲和素的供体微球连接,3种组分与待测抗原形成双抗体夹心结构,680nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,产生520~620nm的荧光,荧光信号与抗原浓度正相关。对该方法的反应体系进行优化,验证其重复性、敏感性和特异性,并采用该方法检测菌液上清和食品模拟样本。结果:所建立的AlphaLISA检测方法重复性较好,批间变异系数和批内变异系数皆小于10%;检测SEE的灵敏度可以达到100pg/mL,并与其他几种毒素均无交叉反应,具有较好的特异性。该方法也能够准确地对金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行检测,对食品模拟样本的检测也有较好的灵敏度。结论:建立了检测SEE的AlphaLISA方法。该方法均相免洗,操作便捷,用时短,灵敏度更高,可对菌液上清和不同食品模拟样本中的SEE进行检测。     

管式磁微粒非洲猪瘟病毒pp62蛋白化学发光抗体检测方法的建立

【背景】非洲猪瘟(African swine fever, ASF)作为高致病性传染病,给我国生猪养殖业造成了严重的经济损失,因此建立快捷、灵敏的诊断方法至关重要。【目的】建立一种管式非洲猪瘟病毒pp62蛋白化学发光抗体检测方法。【方法】以重组pp62蛋白作为包被抗原,羧基磁珠(carboxylic magnetic beads)作为固相载体,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)标记的兔抗猪IgG作为酶标二抗,通过对反应条件进行优化,采用非洲猪瘟国家参考品作为溯源血清绘制出标准曲线,建立基于ASFV pp62蛋白的化学发光抗体检测方法。【结果】用建立的化学发光方法检测277份临床样品血清,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析确定阴性、阳性临界值,并确定判定标准：浓度值>140.02 U时为抗体阳性,浓度值<140.02 U时为抗体阴性。此方法对6种不同的病原血清抗体进行检测均无交叉反应,且批内和批间变异系数均在10%以内,与商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达96.7%。【结论】本研究建立的管式非洲猪瘟病毒化学发光抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为非洲猪瘟早期监测及试剂盒研发提供参考。     

基于磁性纳米微球的Gamma干扰素酶联免疫检测方法建立

目的：建立及评价使用磁性纳米微球作为固相载体的人酌干扰素（Interferon-gamma,IFN-gamma）双抗体夹心酶联免疫吸附实验 （Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法：以杂化细乳液合成法制备磁性纳米微球,将其作为免疫检测的固相 载体。将磁性微球与IFN-酌抗体进行偶联,建立基于磁性微球的ELISA 检测方法,检测人IFN-gamma,绘制IFN-gamma标准曲线并进行方法 学评价。结果：获得包被有人IFN-gamma抗体的免疫微球, 抗体偶联率为54.5 %。用它建立IFN-gamma的双抗体夹心的ELISA 检测方法,检 测范围为0-1000 pg/mL,相关系数为0.9996,灵敏度23.2 pg/mL,功能灵敏度0 pg/mL,批内和批间变异系数（Coefficients of Variance,CVs）＜8 %,检测总共需要2 小时。结论：成功制备了IFN-酌免疫微球并建立了定量检测人IFN-gamma的双抗体夹心磁珠 酶联免疫方法。     

SPR技术在免疫学研究中的应用

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术是研究生物分子相互作用的强有力工具之一,该技术使生物分子之间相互作用的实时检测成为可能,并且灵敏度高、无需标记.通过分析传感图谱及分子相互作用的响应值获取分子相互作用的模式和动力学常数等方面的信息,并且获得的信息是能够定性和定量.SPR技术现在已广泛应用于生物、化学、免疫学研究及新药开发等领域.本文主要就SPR技术在免疫学研究中抗体活性检测、抗原表位预测等方面的应用进行了综述.     

酶联免疫吸附测定中固相化方法概述

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一项应用广泛的固相酶免疫测定技术。抗原或抗体等反应物的固相化在ELISA检测系统中有着十分重要的作用,可直接影响检测结果。应用稳定性好、固相化物质变性率低及固定效率高的ELISA操作体系,可显著提高检测分析的灵敏性、特异性和可靠性。现就ELISA技术中不同固相介质和固相化方法作一概述。     

血清样本急性心肌梗死生物标志物的高通量悬浮芯片检测技术研究

为了建立一种急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)生物标志物的高通量悬浮芯片检测新技术,本研究将肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,c TnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)和肌红蛋白(myoglobin MYO)在悬浮芯片荧光编码微球上进行偶联制备成探针微球,在液相反应体系中,探针微球上结合的AMI生物标志物与样品中相应的标志物共同竞争液相中各自特异性的生物素化单抗,反应后结合生物素化二抗,再结合荧光报告分子后上机检测,获得中位荧光强度值(mean fluorescent intensity,MFI),绘制出3种AMI生物标志物检测的标准曲线,确定了建立的AMI生物标志物的高通量悬浮芯片检测新技术的最低检出限(limit of detection,LOD)、特异性、测量区间、准确度等性能指标,并与实际的患者血清和正常健康人血清中上AMI标志物进行检测。对c TnⅠ、CK-MBⅠ和MYO的LOD为0.002、0.050和0.038μg/L,标准曲线的测量区间在4~5个数量级,方程决定系数R~20.99;其他蛋白标志物所获得的MFI值同空白对照比均未有明显变化。3种AMI标志物检测的变异系数在2.50%~8.68%之间,相对标准偏差在2.50%~7.90%之间,均小于10%。因此,AMI生物标志物的高通量悬浮芯片检测技术可完全可以满足临床检测的需要,该操作简单,灵敏快速,成本低廉,为临床AMI的快速诊断提供了新方法。     

生物可降解微球作为HPV-E7 蛋白免疫佐剂的研究

目的:对聚乳酸聚羟基乙酸(PGLA)作为疫苗运输载体进行免疫学评价。方法:用复乳法制备PLGA微球,通过表面吸附人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白制备成聚乳酸聚羟基乙酸(PGLA)微球,考察粒径分布情况及体外释放水平,通过皮下免疫注射途径免疫C57BL/6小鼠,用间接ELISA法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价PLGA微球疫苗运输载体的佐剂效应。。结果:复乳法制备的PLGA微球表面光滑,大小均匀,包封率20.1%,注射小鼠6周后(第2周加强免疫1次),微球疫苗诱导产生的IgG1抗体水平较同剂量的铝佐剂组和溴化二甲基双十八胺(DDA)组明显升高,(平均滴度分别为3805、1270、2262);微球疫苗诱导产生IgG2b的抗体水平明显高于铝佐剂组,略低于DDA组,(平均滴度分别为1131、475、2653)而IgG2c的抗体量高于铝佐剂组和DDA组(平均滴度分别为150、36、106)。结论:人乳头状瘤病毒E7蛋白聚乳酸羟基乙酸微球作为疫苗输送体系可以明显的提高抗原的免疫原性。     

悬浮芯片技术应用进展

悬浮芯片技术(SAT)是一种新型、高通量的生物芯片技术,它是将流式细胞术、激光技术及应用流体学等技术结合在一起,利用悬浮在液相中的分类荧光编码微球作为检测载体,具有高通量、速度快、灵敏度高、特异性强及检测范围广等特点.近几年来,悬浮芯片技术在免疫学、基因组学、蛋白质组学及临床诊断检测等方面应用较广泛.就其原理、技术特点...     

PLGA人工抗原提呈细胞载体的制备

目的:目前常用的载体材料,在体内很难降解,限制了其在体内的应用,本文通过用PLGA微球制备人工抗原提呈细胞(AAPC)载体,对其功能进行验证.希望此方法能弥补传统方法的不足.方法:将软脂酸偶联到亲和素上,然后按照传统的复乳法来制备PLGA微球,并且通过使用荧光素(FITC)标记、生物素化的牛血清蛋白(BSA)对其功能进行验证.结果:通过该方法可以得到表面固定生物素的PLGA微球,并且证明软脂酸修饰并未影响到亲和素分子和生物素的结合,生物素化的BSA分子可以有效的结合到微球的表面.结论:PLGA微球表面很难引进合适的化学基团,导致其不能像聚苯乙烯微球那样通过化学反应来将亲和素分子固定在微球的表面上,通过将软脂酸偶联到亲和素分子上,可改变其表面很难引进合适的化学基团的不足,用其微球可用于制备AAPC载体.人工抗原提呈细胞是免疫学研究领域的新思路,可在基础免疫研究和临床治疗方面发挥较大的作用,但作为一门新兴技术,在制备、效果评价及应用方面需要逐渐完善和成熟,用PLGA微球为载体构建,弥补了磁珠、聚苯乙烯不能在体内降解的不足,且安全无毒,可供参考.     

荧光素酶在蛋白相互作用研究中的应用

蛋白质相互作用参与细胞的多项生理活动,是生命科学研究的一个重要领域。化学发光,特别是基于生物酶的化学发光即生物发光,提供了极灵敏的检测信号,因而在实际应用中具有诸多优势。荧光素酶如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、海肾荧光素酶,以及近年来出现的几种低分子量荧光素酶,具有不同的酶催化特性及理化特征。它们应用于蛋白质片段互补与共振能量转移技术等各种生化检测方法,为观察蛋白质相互作用提供了更安全便捷的手段,拓宽了蛋白质相互作用检测技术的适用范围。本文综述了常用荧光素酶的特征和它们在各种蛋白质相互作用检测方法中使用的原理、策略及其适用性。     

吖啶酯发光免疫分析技术的研究与发展

目的:为了对吖啶酯发光免疫分析技术的研究与发展有更深入地了解,更加知晓吖啶酯发光免疫分析技术的发展前景。方法:通过对采用吖啶酯发光免疫分析技术治疗的疾病进行分析研究,以及参考最近几年几十篇有关吖啶酯发光免疫分析技术的文献,深入研究近期的20多篇文献。分析吖啶酯发光免疫分析技术在免疫学上的研究及重大突破,整理数据分析吖啶酯发光免疫分析技术在很多领域重大应用。结果:吖啶酯发光免疫分析技术在现今医学有着巨大的贡献,尤其在对测定血清中癌胚抗原(CEA)含量的检测方法和检测人体血清中促甲状腺激素含量的酶促化学发光免疫分析方法中效果显著,值得大力推广。结论:现今社会高速发展,一般的医学检测技术已无法满足日益精进的免疫学技术,于是吖啶酯发光免疫分析技术应运而生,为现今免疫学贡献自己的一份力量,提高人类各个领域技术。     

运用染色质免疫沉淀技术筛选出AP-2α的靶基因GALK1

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay, ChIP ) 是一种近来研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的最好方法之一.本研究利用 ChIP 克隆方法, 找出了 AP-2α所调控的新的下游靶基因 GALK1,并应用 Luciferase assay和 RT-PCR 实验进行了初步的验证.这一新发现,有利于我们进一步研究转录因子AP-2α的功能.     

胶原酶缓释微球的研究

目的:本实验旨在开发一种胶原酶缓释微球制剂,用以治疗手掌腱膜挛缩症,以减小现有水针剂的不足。方法:利用水相-水相乳化法和低温冷冻相分离法两种方法制备载药颗粒,分别将其包裹于PLGA微球内,制备成胶原酶微球,并用扫描电镜考察其表面形态,对其粒径进行统计学分析,测定体外释放行为并比较。结果:两种方法制备的微球表面光滑圆整,都可以达到缓释的效果,一个星期内释药完全。水相-水相乳化法制备的微球比低温冷冻相分离制备的微球粒径大,且具有统计学差异(P0.05)。水相-水相乳化法制备的微球粒径较均一,其体外释放更加平缓,突释较小。结论:本研究制得的胶原酶微球能实现理想的体外缓释效果,解决了现有技术中胶原酶粉针剂型快速释放并分散的问题。     

悬浮芯片在核酸和蛋白质检测中的应用

悬浮芯片是近年来兴起的一种新型检测技术,不同于固相基因芯片,它整合了高分子化学、分子生物学、免疫学、激光检测、微流体、高速数字信号处理、计算机分析等方面的先进技术,能够对少量样本进行高通量的定性、定量检测。主要综述了悬浮芯片技术的基本原理,并概要介绍了其在核酸和蛋白质检测中的应用。悬浮芯片技术在核酸和蛋白质检测中有着显著的优点,如高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等,不但可以广泛应用于科学研究领域,而且还将逐渐普及于临床诊断实验室,具有广阔的应用前景。     

斑点叉尾鲖源海豚链球菌Srr蛋白海藻酸钠-壳聚糖口服疫苗的制备及其免疫效果研究

制备海藻酸钠-壳聚糖-海豚链球菌Srr蛋白微球疫苗, 并检测其对斑点叉尾鲙的免疫效果。采用乳化法利用海藻酸钠-壳聚糖包被Srr蛋白, 测定其包封率、载药率及包被蛋白的抗原性; 通过拌饲投喂免疫斑点叉尾鲙, 分为Srr组、Srr微球组、空微球组以及对照组, 间接ELISA法检测免疫后斑点叉尾鲙的血清抗体水平, 试剂盒检测多项血清非特异性指标; 于免疫后第4周利用海豚链球菌攻毒, 计算各组相对保护率, 并通过实时荧光定量PCR检测相关基因的表达量。结果显示, 通过乳化法制得形态为圆形或椭圆形、大小较为均一的微球疫苗, 粒径为(4.26±1.13) μm, 包封率为92.38%, 载药率为19.41%, Western-blot分析表明Srr蛋白微球具有较好的抗原性; Srr微球组的抗体效价峰值出现在第4周, 明显高于其他组, 血清总蛋白、T-SOD以及溶菌酶活力均显著或极显著高于其他实验组, 并获得60%的相对保护率。荧光定量分析结果显示, Srr微球组攻毒后24h和48h各免疫基因表达量均有所上调。Srr蛋白微球疫苗能够提高斑点叉尾鲙抵抗海豚链球菌的能力, 对海豚链球菌起到了一定的预防作用。     

流式微珠阵列术在医学中的研究进展

随着高分子微球技术的日益创新,流式细胞术与高分子微球技术相结合的流式细胞微球芯片捕获技术也随之产生,流式细胞微球芯片捕获技术又称为流式微球分析技术、流式微球技术、流式微珠阵列术,具有检测灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点,应用前景广阔。我们就流式细胞微球捕获芯片技术在医学中的研究进展做简要综述。