含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白对腹膜透析大鼠腹膜结构和功能的作用

目的:探讨含蛋白转导域的SARA融合蛋白(PTD-SAR/SBD)对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用。方法:每日腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液(PDF)制备腹膜透析大鼠模型。28只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组(n=8);腹膜透析模型组(n=10);PTD-SARA/SBD蛋白干预组(n=10)。4周后行腹膜平衡试验,检测超滤量、葡萄糖吸收率;留取壁层腹膜组织行HE染色;免疫组织化学方法检测大鼠壁层腹膜间皮细胞转分化指标E-cadherin和Twist的表达;Western blotting测定E-cadherin、twist,以及CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3、t-Smad3的表达。结果:①与正常对照组比较,模型组大鼠壁层腹膜增厚,糖转运率增加,超滤量降低(P0.01);免疫组织化学与western blotting检测结果显示E-cadherin表达下调,Twist表达上调;CollagenⅠ、P-Smad3、TGF-β1表达增加。②与模型组比较,PTD-SARA/SBD蛋白干预组大鼠壁层腹膜糖转运率降低,超滤量增加(P0.05);E-cadherin表达上调,Twist表达下调;CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3表达减少,各组t-Smad3无明显变化。结论:PTD-SARA/SBD融合蛋白通过抑制TGF-β/Smads信号通路部分逆转腹膜间皮细胞转分化从而改善腹膜结构和功能,为防治腹膜透析所致腹膜纤维化奠定基础。     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白对腹膜透析大鼠

目的：探讨含蛋白转导域的SARA融合蛋白（PTD-SAR／SBD）对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用。方法：每日腹腔注射4．25％葡萄糖腹膜透析液（PDF）制备腹膜透析大鼠模型。28只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组（n=8）;腹膜透析模型组（n=10）;PTD-SARA／SBD蛋白干预组（n=10）。4周后行腹膜平衡试验,检测超滤量、葡萄糖吸收率;留取壁层腹膜组织行HE染色;免疫组织化学方法检测大鼠壁层腹膜间皮细胞转分化指标E-cadherin和Twist的表达;Westemblotting测定E-cadherin、twist,以及CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3、t-Smad3的表达。结果：①与正常对照组比较,模型组大鼠壁层腹膜增厚,糖转运率增加,超滤量降低（P〈0．01）;免疫组织化学与westernblotting检测结果显示E-cadherin表达下调,Twist表达上调;CollagenⅠ、P-Smad3、TGF-β1表达增加。②与模型组比较,PTD-SARA／SBD蛋白干预组大鼠壁层腹膜糖转运率降低,超滤量增加（P〈0．05）;E-cadherin表达上调,Twist表达下调;CollagenⅠ、TGF-β1、P-Smad3表达减少,各组t-Smad3无明显变化。结论：PTD-SARA／SBD融合蛋白通过抑制TGF-WSmads信号通路部分逆转腹膜间皮细胞转分化从而改善腹膜结构和功能,为防治腹膜透析所致腹膜纤维化奠定基础。     

厄贝沙坦对糖尿病大鼠心肌损伤中Notch1信号通路的影响

目的：观察厄贝沙坦对糖尿病大鼠心肌损伤的作用,分析Notch1信号通路在其中的变化。方法：实验分4组：正常对照组（CON）、高糖高脂组（HC）、糖尿病组（DM）和厄贝沙坦+糖尿病组（Ir+DM）。制作2型糖尿病（T2DM）大鼠模型成功后,第8周开始检测大鼠空腹血糖水平（FBG）、全心质量及左心室重量,计算心脏指数（H/B）及左室重量指数（LVWI）,检测大鼠血浆甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）水平,检测心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量变化,免疫组化检测Bcl-2、Bax表达变化,Western blot检测大鼠心肌组织Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白表达。结果：与CON组相比,HC组H/B、LVWI、FBG无明显变化,血脂、MDA含量明显升高,SOD活性、Bcl-2/Bax及Notch1、Hes-1、Jagged-1蛋白表达降低;与HC组相比,DM组H/B、LVWI、FBG、MDA含量增加明显,血脂水平无明显变化,SOD活性、Bcl-2/Bax及Notch1信号通路蛋白表达进一步降低;与DM组相比,厄贝沙坦干预组H/B、LVWI明显降低,血脂、血糖水平无明显变化,但SOD活性、Bcl-2/Bax增加,MDA含量降低,同时Notch1信号通路相关蛋白表达增加。结论：糖尿病可导致大鼠发生心肌损伤,厄贝沙坦可能通过增强Notch1信号通路的表达发挥心肌保护作用。     

中药乙肝散逆转肝纤维化过程中肝组织TIMP-1及MMP-2表达变化的实验研究

目的探讨中药乙肝散逆转免疫性肝纤维化过程中肝组织TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制因子-1) 及MMP-2(间质金属蛋白酶-2)表达的变化.方法雄性Wistar大鼠尾静脉注射白蛋白建立免疫损伤性肝纤维化模型后,分组加用不同浓度的乙肝散颗粒饲料喂养12周,流式细胞仪定量分析大鼠肝组织TIMP-1和MMP-2基因表达量,观察大鼠肝组织病理、苦味酸-天狼红染色、Ⅳ胶原免疫组化、α-SMA(α平滑肌肌动蛋白)免疫组化、肝匀浆Hyp(羟脯氨酸).结果乙肝散应用组肝组织TIMP-1表达量较模型对照组明显降低(P<0.01),MMP-2变化无统计学差异;同时肝组织Ⅰ胶原、Ⅲ胶原、Ⅳ胶原水平和Hyp含量明显降低(P<0.01或P<0.05).结论中药乙肝散在逆转肝纤维化过程中对抑制肝组织TIMP-1基因表达具有一定作用,TIMP-1在肝纤维化的逆转中起重要作用.     

大鼠肝纤维化组织中TGF-β1的研究

目的 观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在大鼠肝纤维化组织中的动态表达,探讨TGF-β1在肝纤维化中的意义.方法 采用腹腔内注射二甲基亚硝胺(DMN)构建大鼠肝纤维化模型,造模后4天、1周、2周、4周、6周、8周分别检测血清ALT、AST、ALB的变化,同时取肝组织用半定量RT-PCR方法检测TGF-β1 mRNA的表达.采用HE染色及Masson三色染色,光学显微镜下观察肝组织损伤情况.采用单因素方差分析进行多组均数间的比较.结果 肝纤维化模型组血清ALT、AST明显升高,ALB明显下降.TGF-β1 mRNA在对照组大鼠和肝纤维化模型组大鼠肝组织中均有表达.与对照组相比,肝纤维化模型组4天～1周时,TGF-β1 mRNA表达差异无统计学意义(P均＞0.05).2～4周较对照组显著升高(P均＜0.05),4周时达高峰.6～8周较4周时显著下降(P均＜0.05),但仍显著高于对照组(P均＜0.05).8周较6周时下降,差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1 mRNA表达与肝纤维化病程呈正相关(P＜0.01).结论 TGF-β1 mRNA在正常SD大鼠肝脏中有表达,在肝纤维化大鼠肝组织中表达增加,与大鼠肝脏病理分期正相关.     

Notch 通路在大鼠肝纤维化发生发展中作用的初探

目的:研究Notch通路在肝纤维发生发展中作用及可能的分子机制。方法:Wistar大鼠40只随机分为正常对照组与病理模型组,病理模型组皮下注射四氯化碳制备肝纤维化模型。8周后将大鼠处死,取肝组织行病理HE染色评价肝纤维化程度并采用免疫组织化学法检测Notch-1蛋白、E-cadherin蛋白与TGF-β1蛋白的表达。结果:肝组织病理HE染色示肝纤维化大鼠肝脏肝细胞坏死、再生明显,胶原纤维沉积明显增加,肝实质结构紊乱。与正常对照组相比,病理模型组notch-1与TGF-β1蛋白表达明显增加,而E-cadherin蛋白的表达明显下降(P<0.01)。结论:Notch通路在大鼠肝纤维化发生发展中可能起重要作用。     

高糖诱导腹膜间皮细胞发生上皮间质转化中microRNA的异常变化

目的:定腹膜间皮细胞在高糖引起上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中microRNA的表达差异。方法:常规培养PMC细胞,利用高糖培养液刺激诱导腹膜间皮细胞发生EMT,倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,实时定量PCR检测EMT标志基因变化,以此确定高糖诱导EMT的发生。利用特异茎环结构的引物合成microRNA的cDNA,实时定量PCR检测重要microRNA的表达变化。结果:高糖培养液培养腹膜间皮细胞48hr后,细胞形态呈梭形改变,同时EMT标记基因E-cadherin表达明显减低(P0.01),Vimentin表达显著升高(P0.01),说明高糖诱导腹膜间皮细胞发生了EMT。利用microRNA特异的茎环结构引物,实时定量PCR检测结果发现高糖刺激后miR-193a的表达明显上调(P0.01);miR-15a和let-7e的表达明显降低(P0.01);miR-16和miR-21的表达无明显变化(P0.05),同时检测发现高糖刺激后miR-193a的表达水平随刺激时间表达升高。结论:异常变化的microRNA可能对高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT具有重要调控作用。     

中医药防治腹膜纤维化的研究进展

腹膜透析是治疗终末期肾脏病较为有效的方法之一,但是腹膜长期暴露于非生理性的腹膜透析液中（低pH、高浓度葡萄糖以及高渗透压等）会致腹膜纤维化,从而导致腹膜结构和功能的丧失,这是患者放弃腹膜透析的原因之一。现代药理学实验证明,中医药对于腹膜纤维化的防治研究主要集中在腹膜间皮细胞的上皮间质转化方面,通过对细胞因子的作用,保护和／或改善腹膜间皮细胞的功能防治腹膜纤维化。     

自制腹透管腹膜透析相关性大肠埃希菌腹膜炎大鼠模型的建立及腹膜AQP1表达研究

目的通过自制腹透管建立一个便利的腹膜透析相关性腹膜炎大鼠模型,研究水孔通道蛋白1 (aquaporin 1,AQP1)在腹膜炎大鼠腹膜表达情况。方法将60只SD大鼠分为3组,第1组为空白组;第2组为穿刺组,以传统方式直接向大鼠腹腔注射腹膜透析液及大肠杆菌菌液;第3组为置管组,采用医用18G静脉留置针,打侧孔消毒灭菌后,从左下腹迷路穿刺置入腹腔后拔出穿刺针芯,贴无菌膜后固定,消毒留置针硅胶帽后注入大肠杆菌,建立腹膜透析相关性大肠埃希菌腹膜炎大鼠模型。建模后饲养大鼠72 h处死,取大鼠壁层腹膜行病理切片观察腹膜炎细胞浸润情况,同时采用免疫组化法检测AQP1在大鼠壁层腹膜的表达情况。结果穿刺组大鼠存活率为50%,置管组大鼠存活率为85%,两组大鼠的存活率比较差异有统计学意义(P0.05),且两组大鼠壁层腹膜病理切片光镜下均观察到大量炎细胞浸润。空白组、置管组的AQP1表达均明显低于穿刺组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论医用留置针置入大鼠腹腔可建立腹膜透析相关性腹膜炎大鼠模型;AQP1在腹膜透析相关性腹膜炎大鼠的壁层腹膜中表达上调,与大鼠的腹膜炎病情变化程度密切相关。     

HIF-2α/Notch3通路介导CoCl_2诱导的乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭

本研究旨在探究HIF-2α和Notch3在CoCl_2诱导的乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭中的作用。使用CoCl_2于体外建立化学性低氧模型;采用sh RNA技术沉默MCF-7细胞中HIF-2α和Notch3基因;采用RT-PCR法检测MCF-7细胞中HIF-2α、Notch3和Hey1的m RNA水平;采用Western blot方法检测MCF-7细胞中HIF-2α、Notch3、Hey1、Snail和E-cadherin蛋白的表达水平;采用划痕实验和Transwell实验分别检测CoCl_2诱导的MCF-7细胞迁移和侵袭。结果显示,CoCl_2处理可使MCF细胞中HIF-2α、Notch3、Hey1和Snail蛋白表达水平升高(P0.05),E-cadherin蛋白表达水平下降(P0.05),促进MCF-7细胞迁移和侵袭(P0.05);沉默HIF-2α基因表达可抑制CoCl_2诱导的Notch3和Hey1的m RNA和蛋白表达(P0.05);抑制Notch3基因表达后,CoCl_2诱导的MCF-7细胞迁移和侵袭以及CoCl_2对Snail和E-cadherin蛋白表达的调节随之受到抑制(P0.05)。以上结果表明,在CoCl_2化学性低氧环境下,HIF-2α可通过强化Notch3信号通路,进而导致Snail蛋白水平升高和E-cadherin蛋白水平下降,最终提高乳腺癌MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。     

大鼠纤维化肝组织中SHP1表达与肝星状细胞活化及增殖的关系*

目的: 探讨大鼠肝纤维化病理过程中肝组织及在体肝星状细胞 (HSC)的含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1 (SHP1)表达变化与在体HSC活化及增殖的关系。方法: 随机将50只健康雄性SD大鼠分为对照组(10只)、模型组(40只),采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纤维化模型,Masson三色染色及HE染色检测大鼠肝脏组织的病理组织学变化,SHP1与α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)免疫荧光双标记检测大鼠肝组织中活化HSC的SHP1表达,免疫组织化学染色检测大鼠肝组织的α-SMA及SHP1表达,并分别对大鼠肝组织的SHP1表达及大鼠肝组织中活化HSC的SHP1表达与大鼠肝组织的α-SMA表达进行Pearson’s相关性分析。结果: 大鼠肝纤维化模型成功构建,随着造模时间延长,大鼠肝纤维化逐渐加重。与对照组大鼠肝组织的SHP1阳性表达平均光密度值 (MOD) (0.08±0.01)比较,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的SHP1阳性表达MOD (0.11±0.01、0.14±0.01、0.16±0.01、0.19±0.01)显著增加(P＜0.05),并逐渐升高(P＜0.05)。与对照组大鼠肝组织的α-SMA阳性表达MOD (0.04±0.01)比较,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的α-SMA阳性表达MOD (0.06±0.01、 0.09±0.01、0.12±0.01、0.16±0.02)明显增加(P＜0.05),并逐渐升高(P＜0.05),即在体HSC的活化及增殖逐渐加快(α-SMA是HSC的活化标志)。SHP1与α-SMA免疫荧光双标记检测显示,造模2周、4周、6周、8周大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比(26.49%±3.44%、37.14%±4.57%、44.90%±2.94%、58.09%±5.33%)逐渐升高(P＜0.05)。上述大鼠纤维化肝组织的SHP1表达及大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比均与大鼠纤维化肝组织的α-SMA表达呈显著正相关(r值为0.926, 0.984,P＜0.05)。结论: 在大鼠肝纤维病理过程中,肝组织及在体HSC 的SHP1表达与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。     

三七总皂苷对大鼠腹膜纤维化模型氧化应激水平的影响研究

目的通过建立腹膜纤维化大鼠模型,探讨三七总皂苷(PNS)对腹膜纤维化大鼠模型氧化应激的影响。方法 20只SD健康大鼠随机分为空白组(5只)、模型组(8只)和试验组(7只)。空白组每日腹腔内注射生理盐水(100ml/kg),1次/d;模型组每日腹腔内注射4.25%葡萄糖腹透液(100ml/kg),同时隔日联合脂多糖1.2mg/kg腹腔注射(第1、3、5……天),1次/d;试验组每日腹腔内注射4.25%葡萄糖腹透液100ml/kg与PNS(35mg/kg)混合液,同时隔日联合脂多糖1.2mg/kg腹腔注射(第1、3、5……天)。透析28d后,取大鼠壁层腹膜做病理切片观察。检测并比较3组大鼠血清中晚期糖基化终末产物(AGEs)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量。结果光镜下观察壁层腹膜病理切片,模型组大鼠腹膜组织明显增厚,并可见炎症细胞浸润、纤维细胞及血管增生明显增多,而试验组上述改变明显改善。试验组与空白组比较,AGEs、丙二醛明显增高,T-SOD明显减少,差异有统计学意义(P0.05);模型组与空白组比较,AGES、丙二醛明显增加,T-SOD、GSH降低,差异均有统计学意义(均P0.05);试验组与模型组比较,AGEs明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论隔日腹腔注射1.2mg/kg脂多糖,可成功建立腹膜纤维化大鼠模型;PNS可降低AGEs含量,改善腹膜功能。     

中药乙肝散逆转肝纤维化过程中α-SMA阳性肝星状细胞变化的实验研究

目的探讨乙肝散逆转实验性肝纤维化过程中α-SMA阳性HSC变化.方法雄性Wistar大鼠尾静脉注射白蛋白建立免疫损伤性肝纤维化模型后,分组加用不同浓度的乙肝散颗粒饲料喂养12周,流式细胞仪定量分析大鼠肝组织α-SMA阳性肝星状细胞(HSC),观察大鼠肝组织病理、肝组织Lillie和苦味酸-天狼红染色、Ⅳ胶原免疫组化、α-SMA免疫组化、肝匀浆羟脯氨酸.结果乙肝散应用组肝组织α-SMA阳性HSC较模型对照组明显降低(P<0.01),同时肝组织Ⅰ胶原、Ⅲ胶原、Ⅳ胶原水平和Hyp含量明显降低(P<0.01或P<0.05).结论α-SMA阳性HSC减少是实验性肝纤维化逆转过程中重要的因素,乙肝散促进活化HSC减少.     

Notch家族4个蛋白质对人胰腺癌细胞HPAC中YY1和EGFR表达的影响

Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体.Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员.Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存在差异.前期研究显示,Notch1信号通路与转录因子YY1(YING-YANG 1)、表皮生长因子受体(EGFR)间存在调控作用.本研究在人胰腺癌细胞HPAC中,采用RNA干扰技术,分别降低细胞中Notch家族4个蛋白质的表达,检测YY1和EGFR在m RNA和蛋白质水平上的表达;并构建相应的激活形式的Notch受体——Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)真核表达质粒,在HPAC细胞中分别过表达4种NICD,检测其对YY1和EGFR表达水平的影响.结果显示,降低细胞中Notch1或Notch3的表达,均使HPAC细胞中EGFR m RNA和蛋白质水平升高(P0.05),而降低Notch2和Notch4后,EGFR m RNA和蛋白质水平没有改变(P0.05).分别降低4个Notch的表达,对YY1的蛋白质和m RNA表达水平均没有改变(P0.05).在HPAC细胞中过表达N1ICD和N3ICD后,YY1和EGFR的蛋白质水平降低(P0.05),而过表达N2ICD和N4ICD后,YY1和EGFR蛋白质水平没有改变(P0.05).分别过表达4种NICD均没有改变YY1和EGFR的m RNA表达水平(P0.05).初步得出结论是,在HPAC细胞中,Notch信号通路经Notch1和Notch3影响EGFR的表达.Notch1和Notch3对EGFR的表达可能具有负调控作用.在Notch1和Notch3过度激活时,这种调控作用通过YY1介导.本文可为深入研究Notch信号通路对胰腺癌发生发展的作用机制提供有意义的参考.     

Indoxyl Sulfate诱导腹膜间皮细胞转分化的实验研究

目的硫酸吲哚酚(IS)刺激永生化人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)后,研究细胞是否发生上皮细胞-间充质转分化(EMT),同时探索转化生长因子β1(TGF-β1)可能在其中的作用。方法体外培养HMrSV5,传代后,随机将人腹膜间皮细胞株分成以3组:对照组:加入4.25﹪腹膜透析液与培养液共培养;IS处理组:分别用含250μmol/LIS、500μmol/LIS、1 000μmol/LIS浓度的培养液与4.25﹪腹膜透析液共培养;TGF-β1受体抑制剂组:用含2μmol/L LY364947+IS的培养液与4.25﹪腹膜透析液共培养。分别在培养0、4、12、24、48和72 h时间下,采用细胞免疫荧光法观察细胞形态变化,Western Blot法研究细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达规律,48 h时用ELISA法测定纤维连接蛋白(FN),层粘连蛋白(LN5)两种基质蛋白的分泌情况。结果 (1)免疫荧光法显示:与正常细胞比较,IS处理组细胞由典型的铺路样鹅卵石状,逐渐变细变长,呈梭形改变;而TGF-β1受体抑制剂组细胞形态变化不明显,不如IS处理组;(2)Western Blot法检测结果显示:与对照组比较,IS处理组α-SMA的表达水平明显增加,48 h时1 000μmol/LIS表达最明显(39.929±2.610 vs 0.996±0.001;P0.01),差异有统计学意义;与IS处理组比较,TGF-β1受体抑制剂组的表达则明显减少,其中48 h时抑制明显(7.418±3.075 vs 39.929±2.610,P0.01),差异有统计学意义;(3)ELISA法结果显示:与对照组比较,IS处理组基质蛋白FN(1.368±0.040 vs 1.094±0.036,P0.01)、LN5(1.031±0.085vs 0.860±0.063,P0.01)的表达均上调,差异有统计学意义;与IS处理组比较,TGF-β1受体抑制剂组FN(0.925±0.15 vs 1.368±0.040,P0.01)、LN5(0.795±0.426 vs 1.031±0.085,P0.01)分泌均减少,差异有统计学意义。结论 IS可诱导腹膜间皮细胞发生EMT,TGF-β1的参与可能起重要作用,这为治疗腹膜纤维化可能提供新的靶点。     

依那普利在大鼠单侧输尿管梗阻再通模型中的抗纤维化作用

目的:探讨依那普利对大鼠单侧输尿管梗阻再通模型肾脏纤维化的影响.方法:18只SD大鼠随机分为两组:假手术组(6只)以及单侧输尿管梗阻模型组(12只).输尿管梗阻3天后,实施梗阻再通手术,再将大鼠随机分为模型组(6只)以及依那普利组(6只),术后,依那普利组给予依那普利灌胃10mg/kg/d,假手术组以及模型组给予等量0.5%CM-CNa溶液灌胃.用药2周后,取术侧肾组织做HE染色,并采用Raford评分系统对肾间质损伤程度进行评分;用Real-timePCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原以及CT-GFmRNA的表达;用Westemblot方法检测CTGF蛋白水平的表达.结果:模型组大鼠肾脏损伤程度,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平,以及CTGFmRNA和蛋白表达水平均比假手术组明显上升(P<0.01).经依那普利治疗后,与模型组相比,以上指标均显著下降(P<0.01).结论:依那普利能有效阻止大鼠单侧输尿管梗阻再通后肾脏纤维化的进展.依那普利抗纤维化的作用机制可能与抑制CTGF的表达有关.     

丹参酚酸B通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进自噬减轻大鼠心肌纤维化的研究

目的:研究丹参酚酸B(SA-B)能否通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进自噬,从而减轻大鼠心肌纤维化。方法:选用SD大鼠40只,完全随机化分为对照组、模型组、低剂量SA-B治疗组和高剂量SA-B治疗组,采用皮下注射异丙肾上腺素(ISO)构建大鼠心肌纤维化模型。低、高剂量SA-B治疗组在造模同时灌喂丹参酚酸B水溶液,对照组和模型组分别灌胃等体积0.9%生理盐水。测定心重指数(HW/BW)和左心室重指数(LVW/BW);ELISA法测定心肌中Ⅰ型、Ⅲ型胶原水平;Western blot检测自噬相关蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、Beclin1、LC3-Ⅱ水平;大鼠心肌HE染色评估心肌纤维化程度。结果:与对照组比较,模型组中大鼠的心重指数、左心室重指数和心肌中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的水平升高(P0.05),HE染色结果提示心肌组织发生明显的纤维化。模型组大鼠心肌细胞中的自噬相关蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ表达较对照组明显降低(P0.05)。SA-B组中心重指数、左心室重指数和心肌中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的水平明显降低,HE染色未见明显纤维化病灶,其自噬相关蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR表达降低,Beclin1、LC3-Ⅱ表达较模型组明显升高(P0.05)。结论:丹参酚酸B能够抑制ISO所致的大鼠心肌纤维化,且具有剂量依耐性,其机制与抑制PI3K/AKT/mTOR传导通路促进细胞自噬密切相关。     

Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化中的Notch-1/ Twist-1信号通路机制*

目的:通过研究Notch-1/Twist-1信号通路参与Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化(EMT)作用,为阐明肺纤维化(PF)发病机制提供理论依据。方法:动物实验设对照组和博莱霉素(BLM)组(n=15)。气管注射BLM(7 500 U/kg)诱导肺纤维化大鼠模型,造模后28 d取左肺下叶固定于10%福尔马林中,进行HE、Masson及转化生长因子-β1(TGF-β1)免疫组化染色。体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN),细胞实验设对照(Control)组、TGF-β1(5 ng/ml)组、TGF-β1+ Notch-1 siRNA阴性对照组(NC siRNA, 100 pmol/L)和TGF-β1+Notch-1 siRNA干扰组(Notch-1 siRNA, 100 pmol/L),每组设9个复孔。细胞先用NC siRNA或Notch-1 siRNA预处理24 h,再用TGF-β1处理48 h。检测肺组织和(或)II型肺泡上皮细胞内TGF-β1、I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-Cadherin)、Notch-1、Notch-1胞内域(NICD)、Hes-1和Twist-1 mRNA和(或)蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,BLM组肺泡萎缩、塌陷并发生融合,肺泡间隔明显增宽,可见大量炎性细胞的浸润。肺间质胶原纤维沉积明显增多,collagen I和collagen III的表达明显增加(P＜0.01);另外,肺BLM组织中E-cadherin和ZO-1表达明显下降而Vimentin和N-cadherin的表达明显增加(P＜0.01);同时,BLM组肺组织TGF-β1、Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达也明显上调(P＜ 0.01)。细胞实验结果显示,与Control相比,TGF-β1组Notch-1、NICD、Hes-1、Twist-1、collagen I和collagen III的表达明显升高,同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显降低而Vimentin和N-cadherin的表达明显升高(P＜0.01)。与TGF-β1组相比,Notch-1 siRNA能够明显降低TGF-β1诱导Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达(P＜0.05或P＜ 0.01),同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显升高而Vimentin和N-cadherin的表达明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。另外Notch-1 siRNA还能够明显降低TGF-β1诱导的collagen I和collagen III的表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:Notch-1/Twist-1信号通路参与了Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT,可能参与了肺纤维化的发生发展。     

小干扰RNA沉默瘦素揭示了瘦素在大鼠肝纤维化中的作用

目的观察靶向瘦素(leptin)小干扰RNA(interference,siRNA)真核细胞表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。方法采用已构建的重组Leptin-siRNA真核细胞表达质粒,用脂质体包埋法通过腹腔注射将其导入大鼠肝纤维化模型体内。通过HE染色观察肝脏病理形态学变化;Western Blot检测leptin、I型胶原和STAT3蛋白表达变化;半定量RT-PCR检测leptin mRNA表达。结果与正常对照组相比,肝纤维化组(CCl4)和质粒空载体组(CCl4(+)K)肝纤维化程度较重,纤维化评分多为Ⅳ级(P0.01),同时肝脏leptin、I型胶原和STAT3含量明显上升(P0.05);而与肝纤维化组(CCl4)和质粒空载体组(CCl4(+)K)比,leptin-siRNA质粒转染组(The CCl4(+)L)肝纤维化程度减轻,纤维化程度多为Ⅰ-Ⅱ级,肝脏leptin、I型胶原和STAT3表达均显著抑制(P0.05)。正常对照组和leptin-siRNA质粒组(The CCl4(+)L)在组织学及leptin、I型胶原和STAT3基因转录和表达水平无统计学差异(P0.05)。结论 leptin-siRNA表达质粒降低I型胶原和STAT3含量、抑制leptin表达,阻抑肝纤维化;Leptin有望成为肝纤维化基因治疗的新靶位点。     

依帕司他对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的干预作用及其机制

目的:观察依帕司他(EPS)对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠间质纤维化的保护作用及其机制。方法:实验设假手术组(Sham)组、UUO、UUO+EPS(50 mg/kg)及UUO+EPS(100 mg/kg)剂量组,每组n=8。左侧输尿管结扎制备UUO大鼠模型。造模后连续灌胃给药3周,sham和UUO组给予等体积的羟甲基纤维素钠。HE和Masson染色观察肾组织病理变化及胶原沉积情况。免疫组化法观察肾组织醛糖还原酶(AR)表达情况,分别采用real-time PCR和(或) Western blot检测肾脏I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白-1(FSP-1)、纤连蛋白(FN)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生成因子-β1(TGF-β1)和AR mRNA及蛋白表达。结果:与Sham组相比,UUO组大鼠小管上皮细胞萎缩、空泡样变性,肾间质成纤维细胞及肌成纤维细胞大量增殖并伴大量炎症细胞浸润,胶原沉积明显增加,collagen I、collagen III、TGF-β1和AR mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01),同时EMT标志性蛋白α-SMA、FSP-1、FN mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01),而E-cadherin mRNA及蛋白表达水平明显降低。与UUO组相比,经EPS治疗3周后,肾间质纤维化程度明显减轻,胶原沉积明显减少,collagen I、collagen III、TGF-β1和AR mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05),另外α-SMA、FSP-1、FN mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05),而E-cadherin mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01或P<0.05),而且100 mg/kg剂量组上述指标的改变均好于低剂量组(P<0.05,P<0.01)。结论:依帕司他对肾间质纤维化具有一定的改善作用,其机制可能与其抑制TGF-β1介导的AR表达、进而抑制大鼠肾小管上皮细胞EMT有关。