中华眼镜蛇蛇毒因子(CVF)对补体系统的作用及与人补作C_3和其他蛇毒抗原性关系

中华眼镜蛇蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B。HPLC等多次柱层析分离出有抗补体及溶血活性的眼镜蛇蛇毒因子(Cobra venom factor,CVF),纯化后的CVF在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈单一区带,分子量为225000—230000,等电点为6.20。用二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得三类亚基,其分子量总和为237,000。 体外抗补体及溶血试验表明,CVF的作用是通过补体旁路途经使总补体活力下降。双向免疫电泳鉴定,发现CVF与人血清作用后,其中补体成分C_3分子的抗原性发生改变,则表明CVF的作用是通过激活补体成分C_3而发挥的。给豚鼠腹腔注射CVF(0.15ug/g体重)后,其血清总补体水平下降到正常值的3％以下,7天后回升,13天后恢复到正常水平。 单相免疫电泳表明,CVF与人补体C_3抗血清间无任何交叉免疫反应,但人血清与CVF抗血清间有微弱的免疫沉淀反应。另外,CVF的氨基酸组成与人补体C_3也较为相似。鉴定还表明眼镜蛇科中四种蛇毒与CVF抗血清有强烈的免疫沉淀反应,蝰蛇毒及海蛇毒也有免疫沉淀反应,但只有眼镜蛇毒具有抗补体活性。     

中华眼镜蛇蛇毒因子(CVF)对补体系统的作用及与人补体C[3]和其他蛇毒抗原性关系

中华眼镜蛇蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B、HPLC等多次柱层析分离出有抗补体及溶血活性的眼镜蛇蛇毒因子（Cobra venon factor,CVF)，纯化后的CVF在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈单一区带，分子量为225000—230000，等电点为6.20。用二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得三类亚基，其分子量总和为237000。体外抗补体及溶血试验表明，CVF的作用是通过补体旁路途经使总补体活力下降。双向免疫电沪鉴定，发现CVF与人血清作用后，其中补体成分C[3]分子的抗原性发生改变，则表明CVF的作用是通过激活补体成分C[3]而发挥的。给豚鼠腹腔注射CVF（0.15 μg/g体重）后，其血清总补本水平下降到正常值的3%以下，7天后回升，13天后恢复到正常水平。单相免疫电泳表明，CVF与人补体C[3]抗血清间无任何交叉免疫反应，但人血清与CVF抗血清间有微弱的免疫沉淀反应。另外，CVF的氨基酸组成与人补体C[3]也较为相似。鉴定还表明眼镜蛇科中四种蛇毒与CVF抗血清有强烈的免疫沉淀反应，蝰蛇毒及海蛇毒也有免疫沉淀反应，但只有眼镜蛇毒具有抗补体活性。     

眼镜蛇毒中一个新的抗补体蛋白质的分离纯化和性质研究

免疫性疾病、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等病征的发生与补体异常激活密切相关。抗补体药物研究是新药开发的热点之一。本研究旨在从中华眼镜蛇毒中发现并分离纯化获得新的抗补体活性蛋白质,并对其理化性质和生物学活性加以研究。在抗补体活性追踪的指导下,采用蛋白质层析技术对眼镜蛇毒进行分离纯化;利用MALDI-TOF-MS、SDS-PAGE和葡聚糖凝胶过滤法测定目标蛋白质的纯度及分子量;等电聚焦凝胶电泳法测定其等电点;采用Edman降解法测定目标蛋白质的N-端氨基酸序列;测定目标蛋白质对补体经典途径和旁路途径的抑制活性以及可能的机制;采用MTT法和SRB法检测目标蛋白质对肿瘤细胞的杀伤作用;测定目标蛋白质对多种来源红细胞的溶血活性;采用KB平板扩散法检测抗菌活性。结果表明,通过SP Sephadex C-25阳离子交换层析和RP-HPLC C18反相层析,从中华眼镜蛇毒中分离纯化获得一个均一的抗补体蛋白质,将其命名为CTX-CI。还原性SDS-PAGE测得CTX-CI的表观分子量为12. 7 kD,凝胶过滤法测得分子量为9. 7 kD,MALDI-TOF-MS测得精确分子质量为7. 0 kD;变性条件下测得CTX-CI的等电点为9. 81;N-端氨基酸序列为LKCH。相关活性测定结果表明,CTX-CI能有效抑制人血清补体经典途径,其IC50为0. 046 g/L,但对补体旁路途径无明显抑制作用;机制研究表明,CTX-CI能抑制补体经典途径C3转化酶的形成。同时,CTX-CI对肿瘤细胞株A549、K562和MCF-7细胞表现出抑制作用,其IC50分别为0. 32 g/L、0. 58 g/L、0. 63 g/L;对豚鼠红细胞有轻微的溶血作用;能抑制枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长。综上所述,本研究从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的抗补体蛋白质-CTXCI,其理化性质和生物学活性表明其属于细胞毒素,CTX-CI能明显抑制补体经典途径,其机制与抑制经典途径C3转化酶的形成有关。     

眼镜蛇毒中一个新的抗补体蛋白的分离纯化和性质研究

免疫性疾病、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等病征的发生与补体异常激活密切相关。抗补体药物研究是新药开发的热点之一。本研究旨在从中华眼镜蛇毒中发现并分离纯化获得新的抗补体活性蛋白质,并对其理化性质和生物学活性加以研究。在抗补体活性追踪的指导下,采用蛋白质层析技术对眼镜蛇毒进行分离纯化;利用MALDI-TOF-MS、SDS-PAGE和葡聚糖凝胶过滤法测定目标蛋白质的纯度及分子量;等电聚焦凝胶电泳法测定其等电点;采用Edman降解法测定目标蛋白质的N-端氨基酸序列;测定目标蛋白质对补体经典途径和旁路途径的抑制活性以及可能的机制;采用MTT法和SRB法检测目标蛋白质对肿瘤细胞的杀伤作用;测定目标蛋白质对多种来源红细胞的溶血活性;采用KB平板扩散法检测抗菌活性。结果表明,通过SP Sephadex C-25阳离子交换层析和RP-HPLC C18反相层析,从中华眼镜蛇毒中分离纯化获得一个均一的抗补体蛋白质,将其命名为CTX-CI。还原性SDS-PAGE测得CTX-CI的表观分子量为12.7 kD,凝胶过滤法测得分子量为9.7 kD,MALDI-TOF-MS测得精确分子质量为7.0 kD;变性条件下测得CTX-CI的等电点为9-81;N-端氨基酸序列为LKCH。相关活性测定结果表明,CTX-CI能有效抑制人血清补体经典途径,其IC50为0.046 g/L,但对补体旁路途径无明显抑制作用;机制研究表明,CTX-CI能抑制补体经典途径C3转化酶的形成。同时,CTX-CI对肿瘤细胞株A549、K562和MCF-7细胞表现出抑制作用,其IC50分别为0.32 g/L、0.58 g/L、0.63 g/L;对豚鼠红细胞有轻微的溶血作用;能抑制枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长。综上所述,本研究从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的抗补体蛋白质CTX-CI,其理化性质和生物学活性表明其属于细胞毒素,CTX-CI能明显抑制补体经典途径,其机制与抑制经典途径C3转化酶的形成有关。     

补体系统及其糖基化

补体系统是固有免疫系统的重要组成部分,同时也是连接固有免疫和适应性免疫系统的重要桥梁.补体系统由30多种蛋白质组成,且其中绝大多数都经过糖基化修饰.近年来对补体系统的研究,不断揭示出补体系统在抗击病原微生物入侵和维持有机体生理稳态过程中发挥着重要作用.然而补体系统需要严格的调控,不论是激活不足、抑或是过度激活都可能引起疾病的发生.本文概述了近年来对于补体系统的激活、调控和功能研究的最新进展,并首次从糖生物学角度对补体系统蛋白质组分的糖链结构及糖链对相应蛋白质功能的影响进行了综述和小结.     

综述: 补体系统及其糖基化

补体系统是固有免疫系统的重要组成部分,同时也是连接固有免疫和适应性免疫系统的重要桥梁．补体系统由30多种蛋白质组成,且其中绝大多数都经过糖基化修饰．近年来对补体系统的研究,不断揭示出补体系统在抗击病原微生物入侵和维持有机体生理稳态过程中发挥着重要作用．然而补体系统需要严格的调控,不论是激活不足、抑或是过度激活都可能引起疾病的发生．本文概述了近年来对于补体系统的激活、调控和功能研究的最新进展,并首次从糖生物学角度对补体系统蛋白质组分的糖链结构及糖链对相应蛋白质功能的影响进行了综述和小结．     

绿原酸对小鼠急性肺损伤的保护作用研究

本文探讨了绿原酸对补体旁路激活致小鼠急性肺损伤的保护作用及可能的作用机制。将32只KM小鼠随机分为正常对照组、模型组、白藜芦醇组、绿原酸组,预防给药7 d后,用特异性补体旁路激活蛋白眼镜蛇毒因子(CVF)尾静脉注射复制小鼠急性肺损伤模型。测定肺含水量、肺组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)活性、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞数目和蛋白含量,ELISA法检测BALF和血清中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、P选择素(P-selectin)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量,HE染色法观察肺组织病理形态学变化,免疫组化法测定肺组织中NF-κB p65的磷酸化水平。研究发现,绿原酸可以降低小鼠BALF中蛋白含量、炎性细胞数目、IL-6和TNF-α含量以及肺组织匀浆中MPO活性,并可显著降低血清中IL-6、TNF-α及P-selectin、ICAM-1水平;病理形态学显示绿原酸可以显著抑制炎性细胞浸润,免疫组化结果显示绿原酸可显著抑制小鼠NF-κB p65的磷酸化水平。以上结果说明绿原酸可明显减轻补体旁路激活诱导的小鼠急性肺损伤,其机制可能与抑制NF-κB p65的磷酸化及降低炎症反应程度有关。     

补体系统在动脉粥样硬化中的作用

动脉粥样硬化是由脂质和纤维在动脉内膜下的过度沉积造成的,脂代谢紊乱和免疫功能失衡是其最重要的发病机制.补体系统是固有免疫的重要组成部分,是炎症反应的关键启动因子,补体系统介导的免疫应答在动脉粥样硬化的发生中发挥着重要作用.众多研究表明,动脉粥样硬化斑块中存在多种补体成分以及活化产物,提示补体系统的活化和后续的级联反应是...     

眼镜蛇毒临床应用研究概述

我国地域辽阔,毒蛇种类丰富。依托蛋白组学分析,对毒素成分有了相对完整的认识,其中眼镜蛇毒素的临床应用是研究热点。在不同给药途径时,其毒素均能产生镇痛作用,可能与胆碱能系统、内源性阿片系统或补体旁路系统有关;在抑制炎症方面可以提高抗炎因子、降低致炎因子达到平衡状态,起到抑炎作用;在抗肿瘤方面认为可以促进癌细胞的自噬、凋亡;在免疫抑制方面认为可以抑制T细胞周期。本文总结了眼镜蛇毒素各方面临床应用作用及其可能机制,为进一步去挖掘提供方向。     

补体调节蛋白作为靶向补体抑制剂的研究进展

补体是机体免疫系统的重要组成部分,补体系统的过度激活,会直接或间接地导致机体自身组织损伤。补体抑制剂是一类具有调节补体功能的调节蛋白,能够抑制补体过度激活,减轻机体的免疫损伤。将补体抑制剂应用于某些疾病的治疗已经有十多年的历史,但人们已经认识到补体的某些抑制物由于其特异性不强,可能会导致机体系统性的补体抑制,产生副作用。目前,通过利用具有靶向作用的补体抑制剂来抑制补体级联反应中特定蛋白的功能或干扰中性粒细胞同血管内皮细胞的黏附等在许多动物模型中已获得了成功,其中有一些研究成果已经开始应用于临床。本文对补体调节蛋白家族中部分成员作为靶向补体抑制剂的研究进展作一综述。     

戊型肝炎病毒感染激活补体系统

为了探究补体系统与戊型肝炎病毒复制的相关性,分别在HEV感染的A549细胞和BALB/c小鼠中检测C3aR、CD55和CD59蛋白的表达.利用RT-qPCR定量检测细胞和组织中补体的表达,采用免疫组化法检测HEV感染BALB/c小鼠中补体CD59及C5b-9的表达,ELISA检测补体相关炎症因子的变化.HEV感染可以激活补体蛋白C3aR、C5b-9、CD55和CD59的表达,引起补体蛋白相关炎症因子IL-10表达水平下降,IL-12和TNF-α的表达水平的上升,从而导致机体的炎症反应,加剧组织损伤.HEV感染激活补体系统并参与早期的抗病毒反应,HEV感染对补体的持续激活导致炎症因子过度表达,加重机体损伤.     

云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒因子在灵长类动物内应用的免疫原性研究

眼镜蛇蛇毒因子（CVF）能特异性清除机体循环中的补体C3,从而可能在防治补体介导的损伤或疾病中发挥重要的治疗作用。云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒因子（Y-CVF）较文献报道的其他各种CVF具有更高的活性和较少的用药量。为探讨Y-CVF静脉使用是否诱导灵长类动物体内产生特异性中和抗体和异种天然抗体,给2只正常食蟹猴每两周静脉注射一次治疗剂量（0.05 mg/kg）的Y-CVF,共4次,检测注射前后不同时间点血清内补体C3水平、总补体活性（CH50）、抗Y-CVF抗体和抗猪内皮细胞异种抗体的变化。结果显示,前2次注射Y-CVF后均有良好的清除补体效果,第3次注射Y-CVF后补体仅被部分灭活,第4次注射Y-CVF后则基本无效。免疫印迹和酶联免疫吸附试验均证实特异性抗Y-CVF抗体产生,且其滴度随着Y-CVF注射次数增加而递增。多次注射Y-CVF后,并没有在血清内检测到明显的抗猪内皮细胞抗体的变化。因此,多次静脉注射Y-CVF能诱导灵长类动物产生特异性抗体,从而导致Y-CVF失效,但未发现抗α-Gal异种天然抗体明显增加     

云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒因子在灵长类动物内应用的免疫原性研究

眼镜蛇蛇毒因子(CVF)能特异性清除机体循环中的补体C3,从而可能在防治补体介导的损伤或疾病中发挥重要的治疗作用.云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒因子(Y-CVF)较文献报道的其他各种CVF具有更高的活性和较少的用药量.为探讨Y-CVF静脉使用是否诱导灵长类动物体内产生特异性中和抗体和异种天然抗体,给2只正常食蟹猴每两周静脉注射一次治疗剂量(0.05mg/kg)的Y-CVF,共4次,检测注射前后不同时间点血清内补体C3水平、总补体活性(CH50)、抗Y-CVF抗体和抗猪内皮细胞异种抗体的变化.结果显示,前2次注射Y-CVF后均有良好的清除补体效果,第3次注射Y-CVF后补体仪被部分灭活,第4次注射Y-CVF后则基本无效.免疫印迹和酶联免疫吸附试验均证实特异性抗Y-CVF抗体产生,且其滴度随着Y-CVF注射次数增加而递增.多次注射Y-CVF后,并没有在血清内榆测到明显的抗猪内皮细胞抗体的变化.因此,多次静脉注射Y-CVF能诱导灵长类动物产生特异性抗体,从而导致Y-CVF失效,但未发现抗α-Gal异种天然抗体明显增加.     

南蛇簕抗眼镜蛇毒的实验研究

目的探讨南蛇簕抗眼镜蛇毒的作用。方法抗眼镜蛇毒采用鲎试剂试验法。结果眼镜蛇毒与0.5EU/ml鲎试剂产生凝集反应的浓度在7.81μg/ml以上;南蛇簕提取液(含生药)为0.5g/ml浓度时可抗10倍量眼镜蛇毒的凝集反应。结论草药南蛇簕有较强的抗眼镜蛇毒作用。     

C反应蛋白与动脉粥样硬化

人类C反应蛋白 (C reactiveprotein ,CRP)是在感染和组织损伤时血浆浓度快速、急剧升高的主要的急性期蛋白。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用 ,从而清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞 ,在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有 70多年的历史 ,传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物 ,但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病 ,并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子     

p38与脓毒症

近年来在危重病监护方面有重大的进展,但是脓毒症仍有很高的发病率和死亡率[1],其本质是由于感染所致机体过度反应,引发炎症因子的过度分泌而引起的促、抗炎因子平衡失调.脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是引起脓毒症的重要因素之一,它可以激活细胞内多条信号转导通路.丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号转导途径是体内重要的信号转导通路,参与调节胚胎发育、细胞分化、细胞增殖和细胞死亡,其中MAPK家族中的p38与炎症反应有着密切关系.本文着重综述p38的分子结构、p38信号转导通路的激活、p38的底物以及在由脂多糖激活的脓毒症中p38发挥的重要作用和应用p38抑制剂的防治前景.     

肝素的抗补体作用

1929年Ecker和Gross发现了肝素的抗补体作用。当时认为,抗补体作用可能系肝素作用于补体的第三或第四成分(C_3,C_4),使其灭活。随后的报告肯定了这一发现。目前认为,肝素可作用于补体系统的经典途径、替代途径和调控机制,以发挥抗补体作用。一、阻抑经典途径的激活补体系统经典途径的激活是由于C_1活化而启动的。C_1活化通过两种方式进行:(1)抗原抗体复合物形成后,暴露了抗体上的补体结合点(即C_(1q)受体),血清中呈活性状态的     

049甘露糖结合凝集素在严重呼吸综合征病毒感染中的作用

甘露糖结合凝集索（mannose-binding lectin，MBL）是天然免疫中重要的模式识别分子，能在机体产生特异性免疫前，作为体液免疫因子发挥抗病毒作用。MBL可以通过多重糖识别功能域与微生物表面的多糖重复序列结合，经MBL相关的丝氨酸蛋白酶途径，激活补体系统，并增强吞噬作用。为了探讨MBL在严重呼吸道综合征（SARS）冠状病毒感染中的作用，本文作者分析了SARS患者血清MBL水平和MBL基因型与SARS易感的相关性，     

眼镜蛇属神经毒素研究概况

正世界范围内眼镜蛇属约28种[1]。我国有舟山眼镜蛇(naja atra)和孟加拉眼镜蛇(naja kaouthia)两种,前者过去又称为中华眼镜蛇[2]。眼镜蛇是腺管牙类毒蛇,其毒腺分泌的毒液是以神经毒为主的混合毒,即神经毒和血循毒。眼镜蛇毒神经毒素(cobra neurotoxin,CNT)是其毒液中毒性最大的成分,它能使动物产生呼吸抑制和骨骼肌麻痹,甚至死亡[3]。随着分子生物学和蛋白质组学的发展,眼镜蛇毒神经毒素的一些组分已得到分离、纯化、测定,并广泛应用于科研和临床。本文就眼镜蛇毒组分中神经毒素的研究与应用进     

蛇伤药酒抗毒抗菌作用的实验研究

目的探讨蛇伤药酒抗眼镜蛇毒、内毒素及细菌的效果。方法抗眼镜蛇毒和内毒素试验采用鲎试剂法．抗菌试验采用纸片法。结果眼镜蛇毒与0．5EU／ml鲎试剂产生凝集反应的浓度在5．0ug／ml以上;蛇伤药酒浓度1ml／ml时有抗5倍量眼镜蛇毒的凝集反应;有抗2．5倍量内毒素的凝集反应;对多种细菌有抑制作用。结论蛇伤药酒有抗眼镜蛇毒、抗内毒素和多种病原菌的作用。