人TRAIL基因原核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因片段（114～281氨基酸残基）并构建原核表达载体。方法：取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果：从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论：成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

人TRAIL 基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段(114～281氨基酸残基)并构建原核表达载体。方法:取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果:从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论:成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

日本血吸虫32kDa蛋白质基因在真核表达载体中的亚克隆

设计和合成特定寡核苷酸引物,TRIZOL提取日本血吸虫成虫RNA,RT-PCR法扩增日本血吸虫32kDa蛋白质(Sj32)基因编码序列,将扩增产物连接pGEM-T克隆载体,再亚克隆到真核表达载体pBKCMV中.结果RT-PCR法特异性扩增出Sj32编码基因片段,其大小约为1270bp,经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEM-Sj32和pBK-Sj32中含有目的基因.pBK-Sj32重组质粒的成功构建,为进一步表达Sj32及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件.     

人层粘连蛋白α4链LG3组件在克隆、测序及在原核细胞中的表达

用Trizol法提取胎盘组织总RNA,通过RT-PCR方法获得人层粘连蛋白α4链LG3组件的特异扩增产物,将PCR产物克隆入PMD-18T载体中,PCR与酶切鉴定正确后进行序列测定,用测序正确的克隆片段与原核表达载体PET-28a进行体外重组,构建了LG3的原核表达载体,并在BL21（DE3）菌株中得到了表达。     

翅碱蓬CMO基因克隆、测序及植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT-PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶（CMO）cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMOcDNAT-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切鉴定及克隆测序。     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

大鼠低氧诱导因子-1α基因克隆和表达载体的构建

目的:对低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因进行克隆及载体构建,为进一步研究HIF-1基因转染骨髓基质细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤提供实验依据.方法:制备大鼠脊髓缺血再灌注模型,提取脊髓组织mRNA,进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PR)合成HIF-1α cDNA,并对其进行PCR扩增,对PCR产物进行纯化及连接T载体、转化感受态和双酶切鉴定,并将HIF-1α克隆入pcDNA3.1载体.结果:PCR扩增的片段长度为2472bp与预期结果一致;利用BamHI和XbaI双酶切能够切出大小约2472bP的目的片段,与PCR产物片段大小相等,经测序证实无碱基改变.结论:成功克隆HIF-1α,并被构建到载体pcDNA3.1中,为进一步研究基因转染奠定了基础.     

重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Akt1构建及鉴定

目的:构建大鼠Akt1-p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒并鉴定其蛋白表达。方法:提取SD大鼠海马总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠Akt1的c DNAs,将其亚克隆入T载体,双酶切鉴定后将其与经过同样处理的腺病毒穿梭质粒载体p Ad Track-CMV连接,经酶切和测序进行鉴定。将p Ad TrackCMV-Akt1转染293细胞,免疫印迹鉴定Akt1的表达。结果:成功克隆出Akt1目的基因,并将其亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV。免疫印迹结果显示,转染p Ad Track-CMV-Akt1的细胞中能检测出Akt1的特异性条带。结论:成功构建重组大鼠Akt1腺病毒穿梭质粒,且其在真核细胞中能高效表达。     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的：克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法：从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果：通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论：成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。