中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

河内白曲霉酸性α-淀粉酶高产菌株的诱变选育

采用不同浓度的硫酸二乙酯(DES)诱变处理萌发的河内白曲霉孢子,后涂布于筛选培养基,根据透明圈大小初筛高产酸性α-淀粉酶的突变株,并进行摇瓶复筛。结果表明:将萌发的河内白曲霉孢子于1%DES处理20 min,致死率为84.3%,后涂布筛选获得一株高产酸性α-淀粉酶的突变株Hanoi white starter 4,发酵后酶活力达20.8 U/g,比野生菌株提高了61.2%,且遗传稳定性良好。     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

孢子接种生产BF-7658α-淀粉酶

枯草杆菌(Bacillus subtilis)BF-7658在土豆培养基上能稳定形成大量孢子。孢子接种不影响淀粉酶产量。中型生产实验说明孢子接种生产BF-7658α-淀粉酶,产量比较稳定。     

通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株BacilluslicheniformisB0204,再在卡那霉素存在下介导其B.licheniformisB0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。     

通过同源介导α-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一.为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL.将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204,再在卡那霉素存在下介导其B.1icheniformis B0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子.对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定.与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高.其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%.     

淀粉酶生产菌(Bacillus subtilis BF-7658)孢子形成突变体的分离和特性

从一个工业上生产α-淀粉酶的枯草杆菌(Baciltus subtilis)BF-7658菌株中分离出自发的依赖链霉素、抗红霉素孢子形成突变体。这些突变体能正常营养生长,但不能正常形成孢子;同时蛋白酶、抗菌素活性降低,转化分析说明这些性状的改变是单一突变的结果。     

芽胞杆菌属产α-淀粉酶的研究进展

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶,可以从动物、植物或微生物中获得。但应用于工业生产的α-淀粉酶绝大多数来自芽胞杆菌。自α-淀粉酶工业化生产以来,研究人员针对其生产菌株芽胞杆菌进行了一系列的诱变选育和基因工程等分子生物学育种,使得菌种的产酶能力不断得到提高。另外,优化芽胞杆菌发酵培养基及发酵参数也是提高α-淀粉酶工业化生产产量的重要方法。     

应用营养缺陷型回复突变的方法筛选枯草杆菌(Bacillus subtilis)α-淀粉酶的高产菌株

用甲基磺酸乙脂(EMS)处理枯草杆菌(Bacillus Subtilis)BF-7658的孢子,从中分离到氨基酸、维生素和嘌呤、嘧啶的单项和多重营养缺陷型共47株。营养缺陷菌株和原养型的出发菌株比较,除MA-46突变株的α-淀粉酶活力稍高于出发菌株外,其余均有不同程度的下降。α-淀粉酶活力降至原水平1/6—1/9左右的维生素或嘌呤嘧啶缺陷型VPP-36,VPP-37,酶活力完全丧失的脂肪族氨基酸缺陷型NA-27等,经EMS诱发回复突变后,从回复体中分离到α-淀粉酶高产菌株十余株,最高增产幅度比原始菌株达15％以上。     

α—淀粉酶发酵工艺的研究

α—淀粉酶产量最高,用途最广。提高α—淀粉酶生产菌株的产酶活力主要有两个重要问题,一是具有产高酶活的菌株,二是能准确地把握工艺生产条件。本文主要报告α—淀粉酶高产菌种86315的发酵培养基是氮源以棉籽饼粉替代豆饼粉,经正交试验确定最佳发酵培养基配方。待喷发酵液加入0.5％—1％的硼砂,对贮存中的α—淀粉酶有明显的稳定作用,以及在发酵过程中控制好补料等发酵工艺的研究。     

在5L自控发酵罐内热稳定β-淀粉酶的发酵

β-淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依此水解α１４葡萄糖苷键,产生β-构型的麦牙糖,在食品、医药工业上有很大用途,但目前工业上使用的β-淀粉酶大多为植物来源。微生物β-淀粉酶的研究自70年代以来陆续有文献报道^[1-6],但至今人才济济 有理想的工业生产菌株推出。我们实验室经过前几年的研究,已得到一株热稳定β-淀粉酶的产生菌株^[7],但以往的发酵研究都在摇瓶内进行,就生产应用而言,必须进行自控小罐的发酵条件试验,以便逐级放大进行中试,最后达到生产规模。本文报道热稳定β-淀粉酶产生菌高温放线菌A61菌株在5L自控发酵罐内的发酵优化研究。     

利用淀粉直接发酵生产肌苷菌株的构建

以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TF_2为受体菌,利用质粒DNA的原生质体转化法,将携带糖化型α-淀粉酶基因的重组质粒pBX96导入肌苷产生菌TF_2中,转化频率为5.7×10^(-6),获得一株能以淀粉为碳源生产肌苷的转化子T140(pBX96),该工程菌株能在以淀粉为碳源的培养基上平均积累肌苷4.64g/L,经过92代,质粒自发丢失率为0.78％。培养48h后,工程菌株的糖化型α—淀粉酶活力为受体菌的7.79倍。并对工程菌株TI40(pBX96)的发酵条件做了初步摸索。     

热稳定α—淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。     

产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

目的:筛选高产α-淀粉酶菌株,为工业生产α-淀粉酶提供储备菌株。方法:利用碘液显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产α-淀粉酶菌株;通过菌落形态、菌体特征观察和16S rDNA序列比对对菌种进行鉴定;发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后,对其酶学性质进行初步研究。结果:从土壤中筛选到一株高产α-淀粉酶菌株,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XL-15。该菌株所产α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH为6.5;Ca2 和Mn2 对酶有激活作用,而Cu2 、Zn2 和EDTA对酶有抑制作用;酶的动力学研究测出米氏常数Km值为1.726mg/mL。结论:该菌株是产α-淀粉酶的较好材料,且具有一定的应用前景。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶突变株蛋白酶和α-淀粉酶合成的关系

用同步辐射、离子注入和紫外辐射对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)183l菌株辐射诱变后,筛选到四个稳定的蛋白酶突变株。研究了B．subtilis 183l亲株及其蛋白酶突变株的蛋白海和α-淀粉酶合成情况,分析了蛋白酶和α-淀粉酶的合成关系。结果表明,B． subtilis 183l亲株及其突变株在以豆饼粉、玉米粉、麸皮等组成的发酵培养基中,37℃,120r／min培养条件下,各菌株最高α-淀粉酶活力相差不大;中性蛋白酶与α-淀粉酶的合成可能具有相互促进的作用。     

酸性α-淀粉酶生产菌株的选育的初步研究

从淀粉厂的酸性土壤中筛选得到一株生产酸性α-淀粉酶的野生菌,YX-1。此菌株具有较高的产酶能力,初步鉴定为Bacillus stearothermophilus。YX-1能够生产两种α-淀粉酶,在其发酵过程中具有两个产酶高峰,提取两个产酶期的粗酶EI和EII,经特性分析发现两种酶的最适pH值分别为4.5和5.0,最适温度均为60℃。     

α-淀粉酶中型和生产性试验

前文报道了α-淀粉酶高产菌株8_a5的选育及其发酵条件试验,本文报道中型和生产性试验结果。     

阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B1的鉴定

自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis ATCC31272)中分离出了3种不同类型的菌株,其中只有产灰色孢子的菌株能产生阿维菌素(Avermectins),摇瓶发酵单位约100μg/mL。经高频电子流诱变和对发酵培养基的改进,选育出Sa-76菌株,其摇瓶发酵单位可达1000μg/mL。从其菌丝体中提取纯化了阿维菌素B₁晶体,其紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱(¹HNMR和¹³CNMR)和质谱与国外报道的一致。Sa-76菌株又经2次亚硝基胍诱变,筛选出发酵单位2000μg/mL以上的Sa-76-8菌株。在此基础上,再次用亚硝基胍对Sa-76-8菌株进行了诱变,获得Sa-76-9菌株,结合发酵条件的优化,其发酵单位可高达3500～4000μg/mL。     

激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株

将经过20 mW激光辐照20 min的达托霉素(Daptomycin)生产菌株-玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)D-38的孢子悬液倾注在含有1．9λg／mL链霉素的高氏一号培养平板上。通过链霉素抗性法筛选获得了10％正变率的突变株,其中突变株LC-54摇瓶发酵单位为81．2 mg／L,比出发菌株提高了39％。     

固体发酵法生产α—淀粉酶的研究

固体发酵是一种有效的α-淀粉酶的生产方法,它的淀粉酶产酶水平较高,能达1500μ／g,发酵周期60h,发酵培养基为麸皮。