RNA序列测定始末

一、历史的回顾 生物大分子的序列分析,即一级结构的测定,是分子生物学的核心问题,许多科学家为之呕心沥血奋斗终生,取得了巨大成就。 1963年著名的英国科学家Sanger和Thompson揭开了生物大分子序列分析的帷幕,成功的测出了胰岛素51个氨基酸的顺序,获得了1968年诺贝尔奖。1965年Holley等用经典法测定了酵母tRNA~(Ala)的75个核苷酸的全序列。同年Sanger又创造了测定RNA的指纹图谱法,但DNA序列测定的研究工作进展缓慢。     

不断发展的DNA序列测定技术

DNA的核苷酸顺序是分辨率最高的物理图谱,它提供了有关遗传设置的重要信息,因而,测定DNA的核苷酸排列顺序是我们认识基因结构、调节和表达的基础,也是进一步进行DNA大分子操作的前提条件。从1965年Holly等完成了酵母丙氨酸75个核苷酸的测序工作以来,核酸序列分析特别是DNA测序就引起了人们极大兴趣。在短短的二十几年内,DNA测序技术在方法策略、精度和效率等方面都取得了惊人的进展。一、DNA序列测定的基本策略酶法和化学法都是70年代提出的二种DNA测序的方法,到目前为止,它们仍     

限制性片段长度多态性（RFLPS）及其原因

DNA是绝大多数生物(RNA病毒除外)携带和传递遗传信息的复杂的生物聚合体。能被限制性核酸内切酶在特定的核苷酸顺序上切割,形成各种长度的DNA片段,通过电源能将这些片段分开。 生物个体间的差异,本质上是DNA水平上的差异。这是由于进化过程中染色体DNA上核苷酸顺序发生了改变,当这种改变涉及到限制性酶切位点时,酶切后产生的DNA片段长度     

多核苷酸磷酸化酶及其应用(上) 关于酶蛋白的研究

多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide phospho-rylase——Polyribonucleotide:Orthophosphate nuc-leotidyltransferase——E.C.2.7.7.8,以下简称PNPase)是一个很重要的酶,自1955年被Ochoa等发现以来,它在核酸研究的许多方面起了重要的作用。早期利用它合成的多或寡聚核苷酸的物理化学和生物学性质,证实了Watson-Crick关于DNA的双螺旋结构理论,阐明了遗传密码及其阅读方向。最近以来,它对特定顺序寡核苷酸的人工合成和RNA的结构分析等起着多方面的重要作用。PNPase所合     

生物试题的计算与计数

生物学试题中,也有一些涉及计算和计数,它可从一个侧面考查学生对生物学原理的理解和掌握程度。我把生物教学中有关计算、计数题分为四类进行分析讨论(以高考题作为例题)。 1.关于核苷酸与碱基的计算核苷酸是构成核酸(DNA和RNA)的基本单位,而每个核昔酸又是由一分子核糖、一分子碱基和一个分子磷酸组成,因此在核酸中核苷酸和碱基的数目是同一的。在DNA中核苷酸或碱基还是成对存在的。例1.(1987年)根据碱基互补配对原则,并且:A≠C,下列四个式子中正确的应该是:     

重组DNA技术在神经科学中的应用

重组DNA技术是生物工程的主要技术,它在神经科学研究中发挥着重要的作用,形成为一个新的前沿——分子遗传神经科学。重组DNA技术主要包括四方面:(1)用限制性内切酶将DNA切割成特定的片段,(2)用核酸杂交钓出特定的DNA或RNA顺序,(3)DNA克隆和扩增,(4)DNA顺序测定,再根据三联密码推断蛋白质的氨基酸排列顺序,其速度远超过经典的蛋白质化学方法。换言之,重组DNA技术可以将特定的基因从基因库中分离开来,进     

荧光染料菲啶溴红的合成

荧光染料菲啶溴红(简称EthBr或EB)与核酸(DNA、RNA和双链多聚核苷酸)有特异的结合能力,它能反映核酸的量与结构的变化,对体内核酸的合成和有关的核酸酶有抑制作用。菲啶溴红原是五十年代合成的一种抗锥虫药物,1964年发现它与核酸结合后荧光显著增强的现象以来,即被广泛地用作核酸的一     

tRNA研究的近况

转移核糖核酸(tRNA)初期通称为可溶性核糖核酸(sRNA),它的发现已有三十余年的历史。tRNA在蛋白质生物合成的过程中起着关键性的作用,是将核酸的遗传讯息转译成蛋白质一级结构的生物大分子化合物,因此受到重视。早期的研究工作,偏重于从生物材料中分离纯化得到对一种氨基酸专一的纯tRNA,并测定其一级结构(核苷酸排列顺序)。1965年R.W.Holley实验室首先测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构,并因此获得了1968年诺贝尔生理学医学奖。自此以后tRNA的研究一直受到生物化学,分子生物学,分子遗传学等工作     

单链构象多态性分析与应用

单链构象多态性(single-strand conformational poly-morphism,SSCP)是一种简单、方便,且十分有效的分析核酸(DNA或RNA)变异的方法和技术,是Orita等在1989年首先建立的,其基本原理是单链核酸于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率与核酸的一级结构和构象密切相关,核酸序列的变异,甚至单个碱基的改变,都可能改变核酸片段的构象,从而改变核酸的迁移速率,因此可以将“变异DNA”与正常的DNA区分开来。尽管目前还难以根据SSCP电泳迁移率的     

利用序列比较寻找胰岛素基因表达启动区与DNA结合蛋白的结合位点

NDFl、IPFl和HNF4是与胰岛素基因表达有关的DNA结合蛋白,通过比较SWISSPROT蛋白质数据库中人类、小鼠、大鼠这三种核蛋白氨基酸一级序列、模体和结构域,发现其结构十分相似,根据蛋白质结构和功能的关系,推测这些DNA结合蛋白与胰岛素基因结合的核苷酸序列相似;从GenBanl(核酸数据库中获得人类、小鼠、大鼠胰岛素DNA序列,用ClustalW比较三者Promoter区的核苷酸序列,显示有一段核苷酸序列较为相似,同时搜索TRANSFAC基因转录数据库中NDFl、IPFl和NHF4蛋白核苷酸结合位点,发现核酸比对保守的部分序列与TRANSFAC数据库中这三个转录因子的DNA结合位点一致,另外一些核酸保守序列可能为其他未知DNA结合蛋白的结合位点。这种核酸序列比对设计为分子生物学实验寻找和验证胰岛素DNA结合蛋白与核苷酸的结合位点提供了简单而实用的方法。     

核苷酸类似物应用于定向分子进化的研究

核苷酸类似物具有能与天然DNA／RNA中的相应碱基配对的特性,因而在核酸的分子进化及其结构和功能研究领域中具有独特的作用。近年来,核苷酸类似物在迅速发展的定向进化研究领域中,如易错PCR、重组突变以及饱和诱变等技术中,有了越来越多的应用并已取得了许多重要的成果。该介绍应用核苷酸类似物的一些定向进化技术;核苷酸类似物对进化理论研究的贡献及其发展前景。     

G-四链体:核酸的“新”结构

<正>核酸(包括DNA和RNA)是体内最重要一类生物大分子,DNA主要作为遗传信息载体,而RNA则作为信息中介分子、调节因子和酶等发挥多重生物学功能。核酸分子空间结构形式复杂、可变,可采用多种构象,在体内DNA主要为双螺旋结构,而RNA采取单链为主局部双螺旋结构,此外还存在一些特殊结构,如Z-DNA和G-四链体(G-quadruplex)等,这些结构对保证基因组完整性、基因表达和调控都具有重要作用。由于结构     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

G-四联体的生物学功能研究进展

G-四联体是一种特殊的核酸二级结构,广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中,如DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区(5'UTR)序列等。许多研究发现,G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组等生命过程中起着至关重要的作用。目前的研究主要涉及DNA中的G-四联体、RNA中的G-四联体以及人工设计的G-四联体寡聚核苷酸,本文将从这三个方面介绍G-四联体的生物学功能相关研究进展。     

用于DNA或RNA去盐、去蛋白及浓缩的一种方便的新方法

一种新型方便的层析柱,NENSORB~(TM)20核酸纯化柱,已被发展起来,用于从DNA和RNA中除去蛋白、盐、非掺入的放射性核苷酸以及其它低分子量物质。NENSORB20柱的使用免去了酚/氯仿抽提及乙醇沉淀这样一些典型的低得率步骤,也可用于浓缩稀释的核酸溶液。NENSORB20柱已被用来(1)从缺口转译反应混合液中纯化标记的DNA;(2)从SP6RNA聚合酶反应液中纯化标记的RNA探针;(3)纯化有末端~(35)S或~(32)P标记的DNA或RNA;(4)纯化通过M13模板上的引物延伸反应制备出的单链DNA探针;及(5)从限制性酶消化液中纯化DNA片段。 与传统的阴离子交换方法不同,这里洗脱核酸的溶液不需含有盐。DNA和RNA收集在酒精/水溶液中;彻底干燥后,核酸可直接用于进一步的生化反应。在缺口转译、末端标记、克隆、杂交、SP6聚合酶反应、蛋白质反应以及其后的实验中,经NENSORB20柱纯化的DNA或RNA样品都显示出极好的生物学活性。从含有lng到20μg核酸和蛋白的体外反应液中可得到优质、量可重复的收集物(通常60～90％)。     

名词解释

核苷、核苷酸碱基与脱氧核糖或核糖以糖苷键连接而成的糖苷叫做核苷。所含的糖若为脱氧核糖,所形成的核苷叫脱氧核糖核苷:所含的糖若为核糖。则所形成的核苷叫核糖核苷。碱基有多种,组成脱氧核糖核苷的碱基主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)四种:而组成核糖核苷的碱基主要也是四种,但它没有胸腺嘧啶(T),被尿嘧啶(U)所代替。组成核酸的碱基数量都是很大的,排列的顺序富有多样性。核替的糖上再连上一个磷酸,就成为核苷酸。很多核苷酸连接起来,就成为多核苷酸——核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。     

一种灵敏的单链核酸的探针——Tb_(3+)核酸复合物的荧光特性的研究

本文报导了一种对单链DNA灵敏的探针——Tb~(3 )研究了Tb~(3 )-核酸复合物的荧光光谱及激发光谱,实验结果表明,Tb~(3 )与核酸的结合位点主要有两个;核酸上的磷酸部位及鸟嘌呤上的电子供体部位.本文提出了Tb~(3 )可作为测定单链DNA及RNA量的一个较灵敏的方法.     

细菌病毒phi29DNA—装运泵六聚体RNA结构和功能的研究方法

在双链DNA病毒增殖和成熟的过程中 ,需要将相当长的子代DNA装入一个极为有限空间的新生病毒衣壳。整个核酸装壳过程是耗能的过程 ,必需依靠生物泵来将DNA推入壳中。在细菌病毒phi2 9的核酸装壳过程中 ,需要RNA分子作为此生物泵的重要构成组分。6个RNA分子构成一个六边形样螺帽 ,将DNA如螺栓般装入病毒衣壳。6个RNA的这种依次运动的轮流作用模型如同汽车发动机的 6个气缸依次起火的原理一样 ,只是能源来自ATP而不是汽油。综述了此RNA的结构 ,及其结构对其功能所起的重要作用 ,并着重阐述研究 pRNA结构的独特构思和方法     

信息核糖核酸直接在琼脂糖凝胶上的原位杂交检测

核酸印迹法是已被广泛用于检测各种核酸分子及其片段的重要工具。直接在琼脂糖凝胶上做DNA分子杂交取得了很好的结果,但应用于RNA的原位杂交测定的报道还很少。我们用此方法检测了大鼠肝癌BERH-2甲胎蛋白信使核糖核酸,结果良好。现将方法介绍如下: (1) 将BERH-2细胞质总RNA(5—40微克,递     

核酸一级结构研究的进展核酸的特异化学降解与末端分析

目前认为蛋白质生物合成的密码主要决定于核酸的一极结构,也就是决定于核酸分子里核苷酸的排列顺序,显然,核酸一极结构的研究在生物化学的研究领域内是一项重要的课题。近20年以来由于新技术的不断发展和应用,以及生物、化学、物理等学科的紧密配合,核酸的研究工作已获得很大的进展。对核酸的构象、结构、生物功能等都有了不同程