基于基因组编辑技术的大片段克隆新策略

基因组大片段克隆技术是合成生物学研究领域关键的使能技术。传统的大片段克隆技术获取目的大片段的手段存在各种缺陷,比如随机建库克隆需要依靠高通量筛选;PCR难以扩增10 kb以上片段,从小片段拼装费时费力且突变率高;基于限制性酶切连接难以找到片段两端适宜的限制性内切酶酶切位点。最近全基因组合成等前沿研究创造了全新的高性能大片段克隆方法,比如CRISPR/cas9系统中cas9可识别并切割20 bp核酸序列解决了识别位点设计难题,可用来获取任意目的基因片段;组合Gibson或者酵母偶联重组技术组装技术,可高效克隆大片段基因。本文将分类介绍基因组大片段克隆技术,并提出适用不同尺度大小基因克隆的技术选择参考标准。     

植物大片段 DNA 的研究进展

植物大片段 DNA 的研究成为了基因组学研究的一个重要方面．对它的研究得益于容纳大片段 DNA 片段载体的发展．对构建植物大片段 DNA 的载体、植物大片段 DNA 的提取方法、植物大片段 DNA 的主要应用领域的最新进展进行了介绍．     

志贺菌毒力大质粒大片段敲除方法的建立

目的:构建志贺菌毒力大质粒大片段缺失突变体库。方法:首先利用λ-Red重组系统构建弗氏2a志贺菌301株毒力大质粒特定位点缺失株,再在距离此位点20 kb处缺失另一突变位点,最后根据重组酶识别远端FRT位点的特性,将两个远端FRT位点之间的DNA序列全部缺失。结果:敲除了毒力大质粒24 kb的DNA序列。结论:利用λ-Red重组系统及FLP-FRT位点特异性识别重组系统可以对志贺菌毒力大质粒逐步进行大片段的敲除,构建大质粒大片段缺失突变体库。     

水稻双元细菌人工染色体载体系统转化体系的建立

普通双元载体己被广泛碰用于农杆菌介导的植物转化,但这类载体通常只能转移5～20kb的外源DNA片段;而双元细菌人工染色体（BIBAC）载休可以弥补普通双元裁体的不足,通过它已在烟草、番茄等双子叶植物中实现了大片段DNA（150kb）的转移。BIBAC载体在单子叶植物转化中的应用尚未见报道。面于单、双子叶植物间以及大、小片段转化间的转化体系存在明显差异,常规的农杆菌介导的水稻转化体系不能适应BIBAC系统转化的要求。因此,建立适于BIBAC系统的水稻转化体系是十分必要的。通过比较不同的受体材料,不同的预培养、其培养条件,不同的去除农杆菌及选择阳性愈伤的方式等对转化效率的影响,建矿了适合水稻BIBAC系统的转化体系。该体系的技术要点包括：以水稻品种H1493为转化受体：以含毒性辅助质粒pCH32的LBA4404菌株（HP4404）为侵染菌株;预培养的培养拱pH5．6：以N6A代替AAM悬浮农杆菌：侵染菌液浓度为OD600=1．0;共培养温度为24℃;采用过渡（Resting）培养除去农杆菌;采用二步法进行选择等。基于PCR检测、Southern印迹分析的结果表明,BIBAC载体所携带的插入片段及标记基因已整合到转化植株的基因组中。这个体系的建立为在水稻中利用BIBAC系统进行大片段DNA转化奠定基础。     

通过PCR进行长片段DNA的合成

利用PCR合成DNA长片段(Synthesis Large Frament DNA using PCR,SLFD PCR)是一种有效的合成长片段DNA的方法。采用一段已知的500～600bp碱基的DNA片段为PCR模板,根据所要合成的DNA序列可以设计一系列的PCR引物,这些引物都位于模板DNA的5’端,长度为50～60bp,且从5’到3’方向顺序重叠,重叠碱基数目为12～15,全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要合成的DNA。这组引物中最3’端的一条含有一个BamH Ⅰ酶切位点,在该位点后面有15碱基与模板DNA5’端一致的序列。另外还设计一条与该模板匹配的下游引物,引物内也含有一个BamH Ⅰ酶切位点。首先采用5’端最右侧的引物与下游引物进行PCR,在PCR进行10个循环后,以此次PCR的产物为下一轮PCR的模板,该轮PCR采用右侧倒数第二个引物为上游引物,下游引物保持不变。采用类似的方法,完成所有的PCR循环,就可以得到所需要合成的DNA长片段。该方法尤其适合100～200碱基左右的长片段DNA的快速合成与克隆。     

关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

细菌人工染色体（BAC）文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAG文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备,制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切,脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,并结合凝胶回收缩化技术,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关系步骤。     

苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种、猝倒亚种及以色列亚种为材料,介绍了低拷贝大型质粒DNA的小量提取方法,该法采用PEG 6000进行质粒纯化,省略了苯酚和氯仿抽提过程。实验证明,该法结果稳定,提取的质粒DNA产量和质量均符合大多数分子生物学实验的要求。     

携带大片段BIBAC克隆在不同农杆菌中的遗传稳定性研究

大片段克隆在农杆菌中的稳定性是利用可转化大片段载体进行农杆菌介导遗传转化的关键问题.选用插入片段分子质量分别为150kb和50kb的BIBAC克隆,测定了在3种农杆菌AGL-1,EHA105和LBA4404中的遗传稳定性.从第1、3、5次继代培养的农杆菌中抽提的质粒及酶切结果显示,由于农杆菌背景质粒的干扰,难以判断质粒的降解与否.将农杆菌质粒再转化到大肠杆菌宿主中,发现来自农杆菌AGL-1和EHA105的质粒出现了明显的降解,片段变小,而来自农杆菌LBA4404的质粒没有变化.结果表明,大片段BIBAC质粒在不同农杆菌菌株中的稳定性不同,在农杆菌LBA4404中比较稳定,适合用于遗传转化.     

利用抗性互补策略直接克隆染色体上大片段DNA

目的:利用抗性互补策略提高Red重组介导的体内直接克隆效率。方法:将抗性基因(如cat)拆分为互补的两部分Cma、Cmb(部分与Cma同源),这两部分单独均不具有抗性,仅当融合在一起时才有抗性。首先将Cmb定向整合到染色体上拟克隆区域的一侧,然后将含有Cma的线性质粒载体电转到细胞内进行定向克隆。结果:使用该方法,我们成功地将大肠杆菌DH1基因组上约48 kb的大片段DNA克隆到质粒载体上。结论:该方法可用于大片段DNA的功能研究。     

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为7.65 kb,插入子为1.47 kb的片段进行重组连接,使连接效率大大提高.此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的.     

Efficient Amplification of Insert End Sequences from Bacterial Artificial Chromosome Clones by Thermal Asymmetric Interlaced PCR

TAIL-PCR is a powerful tool for the recovery of DNA fragments adjacent to known sequences. A protocol is presented for the amplification of insert end sequences from bacterial artificial chromosome clones using TAIL-PCR. The amplified products are suitable as probes for chromosome walking and genome mapping and as templates for direct sequencing. The protocol has been used in rice genome studies. Abbreviations: AD primer, arbitrary degenerate primer; BAC, bacterial artificial chromosome.