虎源流感病毒HA 基因的系统发生分析及其在杆状病毒系统中的表达

通过对虎源流感病毒A/ Tiger/ Harbin/01/ 2003 (H5N1)的HA 基因进行克隆与序列测定,证明该基因全长为1 731 bp,读码框由1 707个碱基组成,编码568 个氨基酸。对HA 基因的进化分析表明,该基因与H5 亚型流感病毒的HA 基因同源性最高,其HA 裂解位点由6 个碱性氨基酸插入序列(RRRKKR)组成,符合高致病性禽流感病毒的分子特征。将HA 基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ,构建重组质粒pFastBac-HA;再将该重组质粒转化DH10 Bac 感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HA;将Bacmid-HA 转染sf9 细胞,获得重组杆状病毒。经Western-blotting 检测,HA 蛋白在重组杆状病毒中获得表达。用感染重组病毒的sf9 细胞免疫小鼠,2 次免疫后2 周可诱导小鼠产生1∶ 8 ～1∶ 16 的血凝抑制抗体,表明虎源流感病毒的HA 基因在重组杆状病毒系统中得到了正确表达。     

胰蛋白酶消化法测定牛胶原蛋白三股螺旋结构的含量

本研究建立了一种测定胶原蛋白的三股螺旋结构含量的方法。该方法通过使用柱前衍生高效液相色谱(HPLC)法表征经胰蛋白酶酶解后胶原蛋白羟脯氨酸(Hyp)质量浓度的变化,进而对胶原蛋白的三股螺旋结构进行定量。探讨了不同的酶解时间(0~48h)、酶与底物的比例(1∶100、1∶50和1∶20)和温度(20、25、30、37℃)对明胶降解率的影响。获得了酶解的最佳条件——当胰蛋白酶与底物的比例为1∶50时,25℃酶解3h。使用该方法对明胶胶原蛋白混合液检测,结果表明,该方法能灵敏(RSD<10%)的测定胶原蛋白三股螺旋结构的含量。该方法不仅可用于生物组织研究领域,也可用于胶原蛋白食品、保健品和组织工程产品质量的评价。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。     

重组杆状病毒滴度免疫荧光法的建立及验证

目的 建立重组杆状病毒滴度间接免疫荧光法的检测方法,并对其进行验证。方法 构建含有重组质粒pGEX-6p-1-GST-GP64大肠埃希菌BL21(DE3),进行IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导,表达并纯化杆状病毒截短GP64糖蛋白。配伍佐剂后采用背部多点注射的方式免疫日本大耳白兔,制备兔抗杆状病毒GP64多抗作为免疫荧光结合抗体,在96孔板里贴壁培养Sf9细胞,接种10倍系列稀释的重组杆状病毒共孵育一定时间,80%冷丙酮固定、透化,一抗稀释比例为1∶200、荧光二抗稀释比例为1∶500,荧光显微镜下显色,计数荧光灶数目计算病毒滴度。并对建立的方法进行验证。结果 成功制备了GP64兔多抗;检测时Sf9细胞与重组杆状病毒共孵育时间4 d;重组杆状病毒感染细胞可与GP64抗体发生特异的荧光灶反应,未感染细胞对照组未出现特异性荧光灶;组内和组间测定结果的RSD均<5%;同一样品不同人员检测差异无统计学意义(F=1.86,F表);同一样品梯度稀释后,稀释倍数的对数与病毒滴度呈线性相关(R²     

人工扩繁代异色瓢虫卵和成虫最适冷藏条件的探讨

探讨了人工扩繁异色瓢虫时卵和成虫的最适冷藏条件。卵的最适保存温度是 1 0℃ ,冷藏 1 5d内孵化率平均在 60 %以上。成虫的最适保存温度是 1 0℃ ,如将刚羽化的成虫直接在该温度下冷藏 ,冷藏 40d时存活率能保持在 5 0 %左右 ;如将刚羽化成虫先在 1 5℃、0L∶2 4D条件下处理 1 6d,然后置于 1 0℃下冷藏 ,经冷藏 70d后存活率接近 1 0 0 % ,冷藏 90d后存活率仍高于 70 %。表明经一定条件下预处理后再冷藏成虫能保持较高的存活率和较长的存活期 ,可满足人工扩繁时对成虫的冷藏要求。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白.同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高.生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的.     

正交试验优化精制酪氨酸的工艺条件

采用正交实验法 ,将所得实验数据进行统计分析 ,对结晶法精制酪氨酸的工艺条件进行优化。结果表明 :在酪氨酸粗品质量分数为 6 %的溶液中 ,脱色剂ζ(活性炭∶活性白土 ) =3∶1,氨水的浓度为 5 % ,反应终点pH值为 2 .0 ,中和反应恒温水浴的温度为 6 0℃的工艺条件下 ,粗品经一次脱色、结晶就能获得品质合格的产品     

鱼藤酮和茶皂素对槟榔红脉穗螟的联合毒力

【背景】鱼藤酮和茶皂素均为典型的植物源药剂,而两者混配对棕榈害虫的防治效果还未见报道。【方法】采用室内毒力测定方法研究了鱼藤酮和茶皂素以不同比例混配对槟榔红脉穗螟的联合毒力。【结果】鱼藤酮和茶皂素对红脉穗螟3龄幼虫的LC50分别为19.06和35.07 mg·L-1。鱼藤酮和茶皂素以有效成分1∶1、5∶1、1∶2和1∶5混配后,对红脉穗螟均表现出增效作用。其中以1∶5混配处理组的共毒系数最高,达327.26;1∶2混配处理组次之,共毒系数为298.16。【结论与意义】鱼藤酮和茶皂素以合理比例混配,对红脉穗螟具有增效作用。     

高速逆流色谱制备玫瑰红景天中的三种酚性化合物

采用高速逆流色谱方法(HSCCC,High-speed Counter-current Chromatography)同时分离三种玫瑰红景天酚性化合物。玫瑰红景天提取物经聚酰胺吸附多酚后经硅胶柱分级得预分离样品,采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶5∶4∶5,v/v/v/v)组成的两相溶剂系统对预分离样品进行分离纯化,一次进样150 mg,一次色谱分离得到化合物1:68.5 mg、化合物2:8.5 mg、化合物3:45.5 mg,纯度都超过98%。通过ESI-MS、1H NMR对其结构进行鉴定化合物1为没食子酸(Gallic acid),化合物2为没食子酸甲酯(Methyl gallate),化合物3为山奈酚(Kaempferol)。结果表明利用HSCCC可以成功分离三种酚性化合物,分离效果好,产品纯度高。     

非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件(英文)

以少根根霉 (Rhizopusarrhizus)脂肪酶为催化剂 ,有机溶剂为反应介质 ,合成了 3种短链脂肪酸酯 .研究了反应温度、溶剂、底物浓度、底物摩尔比、吸水剂用量等因素对酯化反应的影响 .确定了3种酯的最佳合成条件 :(1)己酸乙酯 :反应温度为 4 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 2 5mol L底物浓度 ,酸醇摩尔比为 1∶1 2 ;(2 )乙酸异丙酯 :5 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 15mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1;(3)乙酸异戊酯 :5 0℃ ,异辛烷为溶剂 ,0 2 0mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1.三种酯合成时均需 0 12 5g ml的0 5nm分子筛为吸水剂 ,在 8h后 ,合成酯转化率达到 97%～ 99% .     

整肠生菌的生长条件和罐上发酵试验*

对整肠生菌进行了最佳生长条件的研究 ,获得了该菌生长的最佳C/N为 4～ 4 5∶1 ,以及所需的各种维生素、氨基酸 ,提出了优化的生长培养基组成。经发酵中试表明 ,在最适pH 5 5～ 6 5 ,最适生长温度 35℃～ 37℃条件下 ,提高菌数产量 3倍。     

重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂的冻干及活性贮存时间估计

研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u- PA)的冻干工艺 ,并对冻干产品的稳定性进行了观察。产品放置在 - 70℃和 4℃一年 ,活性和纯度未见明显变化。同时 ,通过在 80℃、70℃和 60℃的加速贮存试验 ( MIS) ,观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和贮存寿命进行了估算。结果在 37℃、2 5℃、4℃和 0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需时间分别为 1 73天、2 .78年、70 .8年和 1 1 8年 ;活性损失 1 0 %所需时间分别为 2 0天、1 0 0天、7.6年和 1 1年。说明 u- PA经冷冻干燥后保存 ,活性和纯度是稳定的     

芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株某些理化性质的研究

杆状病毒由于其专一致死宿主昆虫、对人畜无害、无环境残留、害虫不易产生抗性等优点,广泛用于农林有害昆虫的防治,但杆状病毒杀虫剂也具有杀虫谱窄、杀虫速度慢等缺点.后来科学家先后发现了广谱毒株——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus AcNPV)、芹菜夜蛾核型多角体病毒(Syngrapha falcifera nuclear polyhedrosis virus SfaNPV),可感染磷翅目三十多种昆虫,前者对已产生农药抗性的常见农业害虫小菜蛾、棉铃虫不敏感,而后者对它们有较高毒力[1～3].我们实验室通过空斑纯化技术得到 Sfa- D 克隆株,此毒株对多种农业害虫具有很强的毒力.本文对该毒株的理化性质做了较为详细的研究,以期为该株病毒的利用提供理论依据.     

正交试验优化亚麻籽拌菜油的工艺

以亚麻籽油为主要原料,在充分利用亚麻籽油独特的香味及营养物质的基础上,将亚麻籽油与辅料蒜、姜、洋葱、花椒、桂皮及香叶（蒜∶姜∶洋葱∶花椒∶桂皮∶香叶=1∶1∶2∶0.5∶0.5∶0.1）混合后在真空状态下抽提一定时间后经过滤制取浓香的亚麻籽拌菜油。正交试验优化结果表明：最佳温度为60 ℃、浸提时间为10 min、辅料与亚麻籽油的比例为1∶10,在该条件下制得的亚麻籽拌菜油风味独特、香气浓郁、色泽好,其品质最高。经测定,油酸13.11%、亚油酸12.5%、亚麻酸42.2%。     

几种药剂对烟蚜毒力的温度效应

在15℃、20℃、25℃、30℃及35℃条件下分别测定了吡虫啉、丁硫克百威和氰戊菊酯对烟蚜毒力的温度效应.结果显示,吡虫啉和丁硫克百威对烟蚜的毒力呈正温度效应,但随着温度上升,烟蚜对吡虫啉的敏感性变化比丁硫克百威大.吡虫啉毒力在35℃时为15℃时的7.12倍;而丁硫克百威为2.88倍.氰戊菊酯对烟蚜的毒力呈负温度效应,在35℃时的毒力约为15℃时的1/5.鉴于这些药剂的毒力受温度影响的规律,建议在气温较低时选用氰戊菊酯等负温度效应的农药,在气温较高时则选用吡虫啉等正温度效应的农药,以充分发挥农药的性能,减少农药使用量、降低防治成本.     

噬菌体phiYe-F10的裂解谱的测定以及裂解能力与宿主毒力基因间关系分析

目的为测定小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体phiYe-F10的裂解谱,分析噬菌体phiYe-F10裂解能力与宿主毒力基因间的关系。方法采用双层平板法观察噬菌体phiYe-F10对213株小肠结肠炎耶尔森菌,36株假结核耶尔森菌和1株鼠疫耶尔森菌的裂解能力;同时对不同来源不同地区的小肠耶尔森菌进行黏附侵袭位点基因(ail)、肠毒素基因(ystA、ystB)、黏附素基因A(yadA)、毒力因子基因F(virF)、O∶3血清型特异性基因(rfbc)检测和血清型别鉴定。结果表明213株小肠结肠炎耶尔森菌包括O∶3血清型84株(其中rfbc+78株),O∶5血清型10株,O∶8血清型13株,O∶9血清型34株,其它及未分型的共72株。携带毒力质粒的典型致病性小肠耶尔森菌(ail+,ystA+,ystB-,yadA+,virF+)77株,毒力质粒丢失的致病性小肠结肠炎耶尔森菌(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)15株,其它非致病基因型121株。噬菌体phiYe-F10裂解71株O∶3小肠结肠炎耶尔森氏菌,其中致病性小肠结肠炎耶尔森菌52株,非致病性小肠结肠炎耶尔森菌19株。对O∶5,O∶9血清型和其它菌株均不裂解,对O∶3的裂解率高达84.5%(71/84)。噬菌体phiYe-F10对假结核耶尔森菌和鼠疫耶尔森氏菌均不裂解。结论:phiYe-F10噬菌体是一株小肠结肠炎耶尔森菌的裂性噬菌体,在25℃时表现出一个典型的窄裂解谱,高度专一性裂解O∶3血清型小肠结肠炎耶尔森菌。phiYe-F10对典型致病性小肠结肠炎耶尔森菌的裂解能力明显高于非致病性的小肠结肠炎耶尔森菌     

昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展

昆虫杆状病毒表达系统 (BEVS)因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点 ,现已成功表达了近千种高价值蛋白。随着杆状病毒载体的不断改进 ,该系统获得重组病毒的几率已从最初的 0 1 %～ 1 %提高到现在的 80 %～ 90 %以上 ,并且出现了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体和高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系。杆状病毒载体将在未来药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。但存在的一些问题如杆状病毒的基因组学研究相对薄弱 ,有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等还不十分清楚 ,表达产物的纯化比较困难 ,多元表达等方面的技术还不够成熟等 ,均有待进一步解决。     

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶 (CGTase)产生菌 4 0 3,96h发酵酶活为 0 95U mL。经紫外辐射和硫酸二乙酯复合诱变而获得突变株CLS4 0 3,96h发酵酶活达 1 36U mL ,提高 4 3%。该突变菌株被鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis) ,产CGTase的最佳碳源为可溶性淀粉 ,最佳氮源为硝酸铵 ,最适初始pH为 6 5 ,最适培养温度为 35℃ ,发酵期间CGTase的产生高峰 (第 96h)滞后于菌体生物量高峰 (第 4 8h) 2d。菌株所产CGTase的最适反应pH为 6 0 ,最适温度为 5 5℃ ,在pH 6 0～ 7 5间和 5 0℃下保持 1h后的剩余酶活均达 90 %以上 ;酶液中适量添加Ca2 能大幅提高CGTase在 5 5℃下的稳定性。经高效液相色谱分析 ,CGTase作用于淀粉后的产物以α 环糊精为主 ,β 环糊精为次 ,二者比例为 2 4 7∶1,环糊精总产率达 2 9 8% ,但产物中不含γ 环糊精     

利用Bac-to-Bac系统表达棉蚜的乙酰胆碱酯酶

Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统是一种高效真核表达系统。采用重组DNA技术构建棉蚜乙酰胆碱酯酶1(AChE1)表达质粒,应用该系统在昆虫Sf9细胞系中成功表达了棉蚜的AChE1。表达的AChE以可溶性形式释放于细胞培养液中,对其自然底物类似物ATChI的Km值为(144·5±28·6)μm;对抗蚜威、唑蚜威、氧化乐果和灭赐松等4种杀虫剂的敏感性指数(Ki值)分别为513、1883、5和23(mM·min)-1,与文献报道的测定结果基本一致。昆虫细胞被重组病毒感染后第2~3天所得产物的活性最高;该产物在-20℃保存90d后活性没有明显下降,4℃保存60d后下降40%,室温(22℃)保存7d后即下降70%。     

低糖山楂果脯加工工艺研究

研究了低糖山楂果脯的加工技术,并对影响低糖山楂果脯饱满度、糖含量等品质因子的关键参数进行了研究。低糖山楂果脯的最佳工艺为：降水分活度柠檬酸∶氯化钠∶丙三醇比例为0.3∶2.0∶1.0、羧甲基纤维素钠和琼脂浓度均为0.5%、糖液浓度和淀粉糖浆均为50%、渗糖5min、浸糖5h、裹包浸泡2~3min（1.0%的羧甲基纤维素钠和1.0%的琼脂的裹包液中加入防腐剂0.01%苯甲酸钠和0.02%的山梨酸钾保鲜效果最佳,微生物污染最小）、65℃烘烤5h,所得产品颜色鲜红,口感酸甜适口,鲜山楂风味浓。