眼镜蛇毒腺cDNA文库的构建

目的　蛇毒含有多种生物活性成分, 从天然蛇毒中提取分离蛇毒有效成分受到蛇毒资源和质量的限制。为开发蛇毒有效成分的基因工程产品, 本研究构建了蛇毒腺的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库, 为进一步筛选、克隆和表达蛇毒有关基因做准备。　方法　从眼镜蛇（ Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ ）毒腺中提取ｍ Ｒ Ｎ Ａ,经反转录合成ｃ Ｄ Ｎ Ａ后, 以λｇｔ１０ 噬菌体为载体, 构建非表达的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库。　结果　蛇毒腺ｃ Ｄ Ｎ Ａ 非表达文库库容量为２×１０６ｐｆｕ／μｇ 重组子, 经大肠杆菌 Ｃ６００ ｈｌｆ 菌株平皿测定, 重组率为 ７０％ 。　结论　经平板鉴定和 Ｐ Ｃ Ｒ 快速鉴定表明, 所构 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库达到建库要求, 能够用于目的基因筛选和克隆表达。     

五步蛇毒血小板聚集抑制因子cDNA的克隆及表达

采用一步法抽提五步蛇毒腺总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ的扩增出低分子量金属蛋白酶酶原的ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。根据推导的氨基酸序列,发现其中一个ｃＤＮＡ除编码一个低分子量金属蛋白酶外,羧基端还包括一个血小板聚集抑制因子,这一结果证实了蛇毒金属蛋白酶和血小板聚集抑制因子起源于蛇毒金属蛋白酶酶原的前体。     

蜂毒溶血肽基因的定点诱变及其在大肠杆菌中的表达

从蜜蜂毒腺中提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的ｃＤＮＡ,再进一步通过定点诱变在蜂毒溶血肽序列前引入了羟胺裂解位点,构建了与β－半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒溶血肽诱变蛋白表达载体,序列分析结果表明,成功地引入了目的密码子且与β－半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框,并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白,为基因工程生产蜂毒溶血肽提供了新途径。     

编码天麻抗真菌蛋白cDNA的分子克隆

用重组ＤＮＡ 技术研究了编码天麻抗真菌蛋白（ＧＡＦＰ）的基因,从天麻（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ ｅｌａｔａＢｌ．）块茎中提取Ｐｏｌｙ（Ａ） ｍ ＲＮＡ 后合成ｃＤＮＡ,构建成表达型ｃＤＮＡ 文库,用纯化的蛋白质探针通过免疫筛选找出对应的ｃＤＮＡ 克隆。在进一步证明所选用的ｃＤＮＡ 克隆含有重组的λ－ｐｈａｇｅ ＤＮＡ 后,提取和纯化含有插入片段重组子的ＤＮＡ,用Ｅｃｏ ＲＩ酶切分析可见插入片段。已分离出编码天麻抗真菌蛋白的基因     

β—银环蛇毒素A链cDNA的克隆和表达

从银环蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,ＲＴ－ＰＣＲ扩增编码β－银环蛇毒素Ａ链的ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。一个新的ｃＤＮＡ得以克隆,其编码一个２７个氨基酸的信号肽和一个１２０个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白和其他β－银环蛇毒素Ａ链一样,具有１３个位置固定的半胱氨酸,而且和这些Ａ链具有很高的同源性。此外,以同样的引物,从眼镜蛇毒腺总ＲＮ中。克隆到编码眼镜蛇ＰＬＡ２前体的ｃＤＮＡ。将β－银环蛇毒素Ａ链和眼镜蛇Ｐ     

蝶兰胚珠的cDNA文库构建及其特异基因表达的研究

以蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ＂Ｍｔ．Ｋａａｌａ”ｃｖＳＭ９１０８）为材料,分别提取大孢子母细胞时期胚珠和成熟胚珠的ＰｏｌｙＡＲＮＡ,反转录成ｃＤＮＡ,构建起两个ｃＤＮＡ文库。克隆筛选采用差异杂交法。从上述两个ｃＤＮＡ,对其在植物体不同器官和不同发育时期的胚珠内的表达进行了分析。结果表明该两个ｃＤＮＡ均为胚珠特异,并且分别在胚珠发育的特定时期表明。推测该两个ｃＤＮＡ的表达受胚珠内部的不同因子调控     

蛇毒的采集与利用

蛇毒是毒蛇头部两侧皮肤下方毒腺的分泌物,在咬啮物体时从毒牙流出,是含多种活性酶的蛋白质。蛇毒虽能伤害人畜,但若能善加利用,可化害为利而成为良药。此外,还可从中提取许多难得的成分作为现代科学研究之用。因而,被誉为“液体黄金”的蛇毒,具有极高的经济价值。现将蛇毒的采集和利用概述如下。     

蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2基因的克隆

从蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．利用人工合成寡核苷酸引物作逆转录,以ｃＤＮＡ为模板进行体外扩增,获得磷脂酶Ａ２（简称ＰＬＡ２）基因,克隆至ｐＢＳ－ｋｓ载体中。通过对３个碱性ＰＬＡ２（简称ＢＰＬＡ２）基因单独克隆分别作ＤＮＡ全序列分析,推导ｐｒｏ－ＢＰＬＡ２由１３８个氨基酸残基构成,与已测定的部分氨基酸序列比较,基本相符。该基因成功的克隆,不仅推导出ＢＰＬＡ２的蛋白质全序列,也为进一步开展蛇毒功能肽蛋白质工程的研究工作打下了良好的基础。     

蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究

从蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓＰａｌａｓ）毒腺中抽提总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ扩增该基因,克隆后经全序列测定,蝮蛇类凝血酶ｐａｌａｓｅ的ｃＤＮＡ长７０８个核苷酸,即编码２３６个氨基酸;根据同源性,推测该类凝血酶ｐａｌａｓｅ的活性中心为Ｈｉｓ４１、Ａｓｐ８６和Ｓｅｒ１８２;二硫键为Ｃｙｓ７Ｃｙｓ１３９、Ｃｙｓ２６Ｃｙｓ４２、Ｃｙｓ７４Ｃｙｓ２３４、Ｃｙｓ１１８Ｃｙｓ１８８、Ｃｙｓ１５０Ｃｙｓ１６７和Ｃｙｓ１７８Ｃｙｓ２０３;该蝮蛇毒类凝血酶ｃＤＮＡ序列及推导的氨基酸序列均为首次报道。构建Ｔ７启动子控制下的ｐａｌａｓｅ的大肠杆菌表达质粒,ＩＰＴＧ诱导ｐａｌａｓｅ获得表达。     

中国野生葡萄葛lei叶绿体DNA质粒文库的构建

限制性内切酶ＢａｍＨＩ水解中国野生葡萄葛ｌｅｉ的叶绿体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）,电泳分离为３４条带,最大为１１．７ｋｂ,最小为０．２３ｋｂ,分别为ｐＵＣ和ｐＢＲ３２２质粒克隆所得片段,转化大肠杆菌,并从转化菌中提取质粒ＤＮＡ,经酶切电泳分析证明含有葛ｌｅｉ ｃｐＤＮＡ经ＢａｍＨＩ水解的不同片段,从而构建了葛ｌｅｉ ｃｐＤＮＡ的ＢａｍＨＩ质粒文库。     

人颌下腺cDNA文库的构建

本研究从新鲜的人颌下腺组织中提取总ＲＮＡ,从中分离出带ｐｏｌｙ（Ａ）尾的信使ＲＮＡ［ｐｏｌｙ（Ａ）〕ｍＲＮＡ］,并合成带ＮｏｔＩ位点的双链ｃＤＮＡ后,接上ＥｏｃＲＩ接头定向插入λｇｔ１１表达载体,经体外包装后转染Ｙ１０９０宿主菌,遂构建成人颌下腺ｃＤＮＡ文库。该文库有４．１×１０５个噬菌体,重组率为１００％,可供寡核苷酸探针和单克隆抗体两种方法筛选目的基因。     

银环蛇神经毒素的分子克隆和功能表达(英文)

抽提银环蛇毒腺总ＲＮＡ,通过反转录ＰＣＲ技术扩增出其神经毒素ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。银环蛇神经毒素的ｃＤＮＡ编码２１个氨基酸的信号肽和７４个氨基酸的成熟蛋白。该信号肽非常类似于短链神经毒素、κ－神经毒素和心脏毒素的信号肽。而成熟蛋白的氨基酸序列与从台湾产银环蛇中通过蛋白测序鉴定的α－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ的氨基酸序列完全一样。此外,还克隆到该神经毒素缺失前体ｃＤＮＡ。利用麦芽糖结合蛋白融合     

尖吻蝮蛇未知C类凝集素蛋白cDNA扩增、克隆与表达

蛇毒中C类凝集素(C-TLs)超家族蛋白,是具有抗凝血等功能的一族蛋白质.根据测得的蛇毒蛋白的N端氨基酸序列,设计PCR引物;从湖南尖吻蝮蛇毒腺中提取总RNA,经反转录,再通过温度降落锚式PCR,在只使用一个特异性引物和一个通用引物、进行一次循环数不超过30的非巢式反应的条件下,即获得两个较为清晰的扩增条带;其中之一带经克隆、测序、比较,证明其与已知的蛇毒中C类凝集素超家族蛋白质有较高的同源性.在大肠杆菌中获得高效融合表达,融合蛋白占细胞总蛋白的26%～30%.     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

中国野生葡萄葛蘲叶绿体DNA质粒文库的构建

限制性内切酶ＢａｍＨＩ水解中国野生葡萄葛（ＶｉｔｉｓｆｌｅｘｕｏｓａＴｈｕｎｂ）的叶绿体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）,电泳分离为３４条带,最大为１１．７ｋｂ,最小为０．２３ｋｂ,分别用ｐＵＣ和ｐＢＲ３２２质粒克隆所得片段,转化大肠杆菌,并从转化菌中提取质粒ＤＮＡ,经酶切电泳分析证明含有葛ｃｐＤＮＡ经ＢａｍＨＩ水解的不同片段,从而构建了葛ｃｐＤＮＡ的ＢａｍＨＩ质粒文库。     

利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

制备基因组ＤＮＡＰＣＲ模板一般都比较费工费时 ,研究人员尝试用微波炉提取真核生物基因组ＤＮＡ ,然后做ＰＣＲ扩增取得了较好的效果[1 ,2 ] 。本文描述了一个利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组ＤＮＡＰＣＲ模板的程序 ,具有良好的重复性。1　材料与方法1.1　材料酿酒酵母菌种 1ｃ163 6ｄａｒｇ11,ｕｒａ 3为比利时ＯｒｉａｎｅＳｏｅｔｅｎｓ馈赠。酵母载体ｐＹＸ13 3从美国康乃尔大学曹维国处获得 ,并由此构建了粗糙脉孢霉ａｒｇ 13ｃＤＮＡ的酵母表达载体ｐＹＸＡ5。培养基为ＳＤ或ＹＰＤ固体培养基。1.2　酵母质粒提取[3]取 1.5ｍｌ…     

两个金环蛇蛇毒磷脂酶A2基因的克隆与序列报道

从广西产金环蛇（Bungarus fasciatus)毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建了金环蛇毒腺cDNA文库,根据已发表的眼镜蛇科蛇毒磷脂酶A2基因序列中的保守区设计探针筛选克隆,得到2个磷脂酶A2基因,测定两者序列,其cDNA的阅读框均为435bp,编码145个氨基酸的磷脂酶A2前体,其中包括27个氨基酸组成的信号肽,118个氨基酸组成的成熟蛋白质,两者均属于第一类磷脂酶A2,其等电点经计算机软件推算分别为7．96和7．95。根据序列比较分析,这2个磷脂酶A2基因所编码的蛋白质序列结构均区别于已报道的金环蛇蛇毒磷脂酶A2,是2个新的金环蛇蛇毒磷酯酶A2,分别命名为金环蛇蛇毒磷脂酶A2Ⅰ（Bf-PLA2I)和金环蛇磷脂酶A2Ⅱ（Bf-PLA2Ⅱ)。     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。     

鳄梨冷藏过程中体外转译和基因表达的研究

鳄梨果实经低温贮藏一定时期,从中提取ＲＮＡ,进行体外转译和同源探针杂交分析,以研究冷藏过程中特写基因的表达时期和水平。并用纯化出的冷藏果实的ｍＲＮＡｓ,构建其ｃＮＤＡ文库。对文库作了初步筛选,２４个含ｃＤＮＡ插入片段的菌落能差示地与贮藏前和７℃贮藏的ｍＲＮＡ合成的探针杂交。３个纤维素酶ｃＤＮＡ能很好杂交,２个与鳄梨乙烯形成酶ｃＤＮＡ有同源性。     

关于部颁降纤酶标准（试行）有关部分的商榷

１　历史回顾　　实践证明,从蛇毒中提取的凝血酶样酶（ｔｈｒｏｍｂｉｎＬｉｋｅｅｎｚｙｍｅ,ＴＬＥ）即降纤酶,是诸多治疗血栓病药物中最为理想的。７０年代初,伦敦Ｔｗｙｆｏｒｄ药厂生产出Ａｎｃｒｏｄ,其后瑞士Ｐａｎｔａｐｈａｒｍ药厂生产的Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ,有效成分均为ＴＬＥ,近年从日本引进的东菱精纯克栓酶注明为单成分ＴＬＥ。　　我国８０年代由中国科学院昆明动物研究所首先从尖吻蝮蛇毒中获得ＴＬＥ,研制出“去纤酶”,为我国第１个用于治疗血栓病的蛇毒酶产品,１９８３年云南省卫生厅批准生产。经临床应用…