中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针,经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交,克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因,大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ）,推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性;与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ和ＯｐＭＮＰＶ也具有一定的同源性     

粘虫核型多角体病毒凋亡抑制基因的定位,序列和启动子结构

以ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５为探针,与ＬｓＮＰＶＤＮＡ的限制性片段和ＬｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ片段杂交,发现ＥｃｏＲＶ５．５ｋｂ片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后,测定了１２４４ｂｐ序列,发现一个完整的ＯＲＦ,推导的３０２个氨基酸与ＡｃＮＰＶｐ３５蛋白有７０．４％的氨基酸同源性,证明所测ＯＲＦ为ＬｓＮＰＶ的ｐ３５基因。结构分析发现其５′端有早期基因启动子元件ＧＣ、ＡＣＧＴ和ＴＡＴＡｂｏｘ。有２２ｂｐ的顺向重复序列,包括由两个重叠的ＴＡＴＡｂｏｘ和上下游两个ＡＣＧＴｍｏｔｉｆ组成的两套启动子元件,这些结构特征与ＡｃＮＰＶ的凋亡抑制基因十分相似。     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因核苷酸序列及其在Baculoviridae中的地位(英文)

茶尺蠖核型多角体病毒（ＥｏＳＮＰＶ）基因组的ｐｏｌｈ和ｅｇｔ基因区约１４．２ｋｂ的酶切图谱被构建．ｅｇｔ基因位于ｐｏｌｈ基因上游约４．８ｋｂ处,但转录方向与ｐｏｌｈ基因相反．ＥｃｏＲⅤ－Ｌ片段ｐｏｌｈ基因及其旁侧的１１２５核苷酸序列被测定．ｐｏｌｈ基因编码区长７３８核苷酸,可编码２４６氨基酸的多肽．起始密码子ＡＴＧ上游是一个富含ＡＴ（ＡＴ占７１．２％）的启动子区,在－５２核苷酸处有杆状病毒晚期基因启动子转录起始基序ＡＴＡＡＧ．在终止密码子下游２０８核苷酸有一个ｐｏｌｙ（Ａ）信号,ＡＡＴＡＡＡ．但ＥｏＳＮＰＶｐｏｌｈ基因起始密码子ＡＴＧ相邻核苷酸序列为ＧＴＡＡＴＧＴ,其－３是个Ｇ,这与已知的１６种其它杆状病毒ｐｏｌｈ基因－３位置均是Ａ不相同．在分析了ＥｏＳＮＰＶ和ＨａＳＮＰＶ多角体蛋白基因核苷酸序列的基础上,通过ＭＡＬＩＧＮ程序,比较了目前已发表的２６种杆状病毒包涵体蛋白的序列,ＥｏＳＮＰＶ与黄杉毒蛾核型多角体病毒（ＯｐＳＮＰＶ）的同源性为最高,核苷酸序列的同源性为８３．０％,氨基酸序列达９４．７％;与其它２０种鳞翅目ＮＰＶ的同源性也很高,核苷酸序列同源性为７２．６％～８１．９％,氨基酸序列为８３．７％～９３     

家蚕核型多角体病毒gp64基因的克隆和全序列测定

：Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因在杆状病毒分子生物学和杆状病毒表达系统研究中具有重要的作用,以ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ 基因为探针,杂交显示Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因定位于其基因组Ｂａｍ ＨＩ酶切的４ ．２ｋｂ 和７－４ｋｂ 片段上,克隆阳性片段,重组质粒分别命名为ｐＺＤＢＭ４２ 和ｐＺＤＢＭ７４ 。对重组质粒进一步杂交,将片断更精确定位于０－４５ｋｂ 片段、０－７５ｋｂ 片断上和１－１５ｋｂ 片断上,将三个片断ＤＮＡ 进行序列分析,结果表明：Ｂｍ ＮＰＶ 的ｇｐ６４ 基因的开放阅读框（ＯＲＦ） 有１５３０ 核苷酸,编码５０９ 个氨基酸。序列同源性比较显示,Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因和ＡｃＭＮＰＶｇｐ６４ 基因的核苷酸序列同源性达８４－３ ％ ,氨基酸序列同源性达９４－７ ％ 。Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因Ｃ 端的信号肽序列和Ｎ 端的锚定序列对于Ｂｍ ＮＰＶ 表达系统的改进具有重要的意义。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的ＶｅｒｏＥ６细胞裂解液中提取病毒ＲＮＡ,经逆转录ＰＣＲ获得病毒Ｓ基因编码区约１．３ｋｂｃＤＮＡ片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒７６１１８株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为８６％,推导的氨基酸序列同源性为９７％。将该基因片段插入原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为ＧＳＴＮＰ融合蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表达蛋白分子约７２ｋＤ左右。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＥＬＩＳＡ试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的ＭｃＡｂ发生反应,其抗原表位及ＭｃＡｂ反应谱与７６１１８株相比存在某些差异。     

棉铃虫核型多角体病毒Hind III-K片段的核苷酸序列及其分析

测定了棉铃虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）基因组ＤＮＡ的ＨｉｎｄＩＩＫ片段核苷酸序列。该片段全长３２５５ｂｐ,含可编码大于４０个氨基酸残基的多肽的开放阅读框（ＯＲＦ）１５个,包括多角体蛋白（ｐｈ）基因编码区３′端４８９ｂｐ和蛋白激酶ＨａｖＰＫ基因编码区８０１ｂｐ。在ｐｈ和ＨａｖＰＫ两基因之间鉴定出一个可编码４１２个氨基酸残基的ＯＲＦ１２３６,转录方向与ｐｈ和ＨａｖＰＫ基因相反。同源分析表明,ＯＲＦ１２３６与谷实夜蛾（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ）核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）的ＯＲＦ８推导的蛋白氨基酸序列有９５．９％同源性,与苜蓿丫纹夜蛾（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）ＯＲＦ１６２９只有２４．８％同源性,但三者均含有二组由多个脯氨酸残基串联而成的特征基序。     

携带p53基因的重组腺病毒的构建及对肿瘤细胞抑制的研究

１　材料与方法１１　质粒ｐＣＭＶｐ５３ＢＡＭ由美国约翰·霍普金斯肿瘤中心ＢｅｒｔＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ教授赠送［５］;ｐＲＳｅｔＡ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司;ｐＣＡ１３和ｐＢＨＧ１１为ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ．产品。ｐＢＨＧ１１包含腺病毒Ａｄ５基因组３６ｋｂ中的约３４ｋｂ序列,但Ａｄ５Ｅ１区１８８ｂｐ至１３３９ｂｐ缺失,代之以氨苄青霉素抗性基因和复制起始位点。ｐＢＨＧ１１缺少包装信号φ（２２ｂｐ至３４２ｂｐ）和Ａｄ５Ｅ３区（２７８６５ｂｐ至３０９９５ｂｐ序列）。ｐＣＡ１３…     

棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的表达

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ Ａｃ Ｎ Ｐ Ｖ） 凋亡抑制基因ｐ３５ 的合成引物,从棉铃虫核型多角体病毒（ Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ） 基因组中用 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增到了１ｋｂ 片段。采用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 双脱氧核苷酸链终止银染法,测定了所扩增到的１ ０１０ｂｐ 全序列,发现其开放阅读框完整,长８９７ｂｐ ,编码２９９ 个氨基酸。用 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ 和 Ｐ Ｒ Ｏ Ｓ Ｉ Ｓ 软件分析发现,此片段与 Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ ｐ３５ 基因同源区核苷酸同源性为９１ ％ ,氨基酸同源性也达８１ ％ ,证明了所扩增的片段是 Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ 的ｐ３５ 基因。为了研究此ｐ３５ 基因的功能及其效应机制,克隆了这一基因并在大肠杆菌细胞中实现了表达。     

斜纹夜蛾核多角本病毒（SpltNPV）基因组4.73Kb片段的？…

报道了斜纹夜蛾核多角体病毒（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ,ＳｐｌｔＮＰＶ）基因组ＥｃｏＲＩ－Ｅ片段中长４７３０ｂｐ的序列分析结果。该序列上含有完整的ＳｐｌｔＮＰＶ ｏｄｖ－ｅ６６基因,一个开入读码框ＯＲＦ １０８６（ＡｃＭＮＰＶＯＲＦ１０９的同源区）和一类似亮氨酸拉链蛋白的基因（命名为ｐ３４基因）。序列比较分析表明,ＳｐｌｔＮＰＶ ｏｄｖ－ｅ６６基因     

粘虫核型多角体病毒多角体蛋白基因结构和序列的研究

测定了粘虫核型多角体病毒（Ｌｅｕｃａｎｉａｓｅｐａｒａｔａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＬｓＮＰＶ）两个ＥｃｏＲＶ片段的共１２０１ｂｐ序列,发现了一个７１４ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）,根据其与多种ＮＰＶ多角体蛋白基因（ｏｃｕ）同源性的比较和５＇端典型的１４ｂｐ保守序列,说明此ＯＲＦ即为ＬｓＮＰＶ的ｏｃｕ基因。根据核苷酸序列预测的多角体蛋白有２４６个氨基酸,其中酸性和碱性氨基酸数相等,疏水氨基酸含量很高,氨基酸组成中以谷氨酸（Ｇｌｕ）含量最高,谷氨酰胺和半胱氨酸含量最低。编码区碱基同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．０％;氨基酸同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．５％。密码子偏爱选用以第三个碱基为嘧啶的密码子。二级结构分析表明,α－螺旋（Ｈ）和β－折叠（Ｓ）相等,β－转角含量是Ｈ和Ｓ含量之和。     

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)

克隆了棉铃虫Helicoverpaarmigera单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)C1株基因组DNA ,并通过随机测序的方法测定了经XbaI酶切后的H片段的核苷酸全序列。序列比较和分析发现该片段中ORF1 3与苜蓿丫纹夜蛾Autographacalifornica多粒包埋型核型多角体病毒 (AcMNPV)基因组ORF1 47(ie 1 )同源。ie 1基因编码区全长 1 986bp ,根据推测的氨基酸序列 ,可编码 6 6 1个氨基酸残基组成的多肽 ,预计分子量为 76 .5kD。将所推导的HaSNPVIE 1氨基酸序列与其它已知的杆状病毒IE 1氨基酸序列进行比较 ,结果表明 ,HaSNPV和谷实夜蛾H .zea单粒包埋型核型多角体病毒IE 1氨基酸序列最为相似 ,同源性高达 98%。与AcMNPV、家蚕Bombyxmori核型多角体病毒 (BmNPV)、云杉卷叶蛾Choristoneurafu miferana多粒包埋型核型多角体病毒 (CfMNPV)、舞毒蛾Lymantriadispar多粒包埋型核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾Orgyiapseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒 (OpMNPV)、甜菜夜蛾Spodopteraex igua多粒包埋型核型多角体病毒 (SeMNPV)、小菜蛾Plutellaxylostella颗粒体病毒 (PxGV)和Xestiac ni grum颗粒体病毒 (XcGV)的IE 1氨基酸序列同源性较低 ,分别为 2 3 %、2 3 %、2 3 %、2 5 %、2 3 %、1 4%、2 7%和 7%。根据氨基酸序列由GENETYX     

杆状病毒p74基因具有种属特异性

选用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒 (AcMNPVbacmid)为材料 ,通过在大肠杆菌中利用RecA基因介导的同源重组 ,将其p74基因剔除 ,并精确地用斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)的p74基因进行了替换。所构建的重组AcMNPV杆粒在修饰后的p74基因位点中未留下任何有可能影响该基因表达及功能的选择标记 ,SpltMNPV的p74基因直接位于AcMNPVp74基因的启动子控制下。RT PCR显示替换后的p74基因得到了表达。生物测定结果显示 ,重组病毒AcMNPV杆粒 polhSL74无法通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫 ,表明杆状病毒p74基因具有种属特异性。     

Nucleotide sequence and molecular characterization of the structural glycoprotein gp41 gene homologue of Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus (spltNPV-I)

The structural glycoprotein gene gp41 homologue of Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus (SpltNPV-I *) was identified in the 4.0 kb EcoRI-L fragment of the viral genome. The nucleotide sequence of 2063 bp of this fragment revealed an open reading frame of 1014 nucleotides to encode a polypeptide of 337 amino acids. Analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences of the putative ORF indicated its identity with gp41 protein of other baculoviruses sharing maximum homology with that of Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrosis virus (SfNPV). The coding sequence was preceded by an AT-rich region containing the consensus baculoviral late promoter motif RTAAG. The putative SpltNPV gp41 ORF was abundantly expressed as a 37 kDa apoprotein in E. coli and as a 50 kDa glycoprotein in Sf9 cells. The recombinant protein expressed in insect cells was glycosylated (20%) and has GlcNAc as the terminal sugar. The gene is conserved among baculoviruses and places SpltNPV-I close to Spodoptera frugiperda and Spodoptera exigua NPVs in phylogenetic tree.     

Structure of immunoglobulin gamma 2b heavy chain gene cloned from mouse embryo gene library.

A mouse DNA clone containing the constant part of the immunoglobulin gamma 2b heavy chain was isolated from a mouse gene library. The library was constructed in Charon 4A from a partial EcoRI digest of mouse embryo DNA and was screened with a plasmid (p gamma (11)7) containing a cDNA insert of the heavy chain constant region of the plasmacytoma MPC-11 (1). The Charon 4A clone contains a 14 kb insert which is cleaved by EcoRI into a 6.8 kb and 7.2 kb fragments, of which only the 6.8 kb contains the sequence for gamma 2b heavy chain. Restriction analysis and partial sequence of the insert in p gamma (11) 7 enabled us to obtain three fragments corresponding to the 5' (amino acid 161-302) middle (amino acid 302-443) and 3' (mostly non coding 107 bp) regions of the constant region. Restriction analysis of the Charon 4A clone and hybridisation to these nick translated fragments revealed that the gamma 2b constant region gene contains about 1.5 kb and has three intervening sequences.     

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同