乙型肝炎病毒preC／C基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过ＰＣＲ获得长度为６４０ｂｐ的ＨＢＶ ｐｒｅＣ／Ｃ基因片段,将其克隆入转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４,构建出重组质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＝Ｘ３／４－ｐＣ＝Ｃ。利用共转染的方法,构建出既能形成多角体又能表达ｐｒｅＣ／Ｃ基因的重组毒株ＴｎＮＰＶ－Ｃ／Ｃ－ＯＣＣ＾＋。该重组毒株中ｐｒｅＣ／Ｃ基因受到串联的双启动子－合成启动子和含ＨｉｎｄⅢ接头的ＸＩＶ启动子的双重调控。     

荧光素酶基因的克隆表达及其产物纯化和鉴定

利用能形成多角体的杆状病毒载体系统ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３,把萤火虫荧光素酶（Ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ,Ｌｕｃ）ｃＤＮＡ克隆到转移功体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋３／３通过共转染草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ,Ｓｆ）细胞得到重组毒株ＴｎＮＰＶ－Ｌｕｃ－ＯＣＣ,在该重组杆状病毒株中Ｌｕｃ基因受到合成启动子和ＸＩＶ启动子的双重调控。该重组杆状病毒株在Ｓｆ９细胞中能形成多角体,有Ｘ－     

牛疱疹病毒Ⅰ型前早期基因BICPO的表达对牛免疫缺陷病毒LTR的反式激活作用

由含有ＢＨＢＶ－１（ＢｏｖｉｎｅＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓ－１）前早期基因的基因组片段亚克隆ＢＩＣＰＯ（ＢＨＶ－１ＩｎｆｅｃｔｅｄＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎＯ）的ＤＮＡ序列至表达载体ｐＳＶＫ３,构建质粒ｐＳＶ２．９。将该质粒与ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,ＢＩＣＰＯ的表达产物可以显著地激活ＢＩＶＬＴＲ启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据ｐＳＶ２．９与含有ＢＩＶＬＴＲ不同区段缺失的质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ、ｐＤ－１１５－Ｌｕｃ、ｐＤ－５２－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞的实验结果,推测ＢＩＶＬＴＲ－３１９位上游区的ＤＮＡ序列影响ＢＩＣＰＯ基因产物对ＢＩＶＬＴＲ表达的激活作用。     

金鱼生长激素II基因在杆状病毒中的表达

以ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３为转移载体,将编码金鱼生长激素Ⅱ的ｃＤＮＡ插入粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）基因组中,构建了重组病毒株ＴｎＮＰＶ－ＳＸ＾＋ｇｆＧＨⅡ４６。该毒株能在草地贪夜蛾离体培养细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素基因。蛋白免疫印迹表明,表达的生长激素蛋白分子量为２２．５ｋＤａ,与理论计算值相符,且表达的生长激素可分泌到感染细胞的培养基及虫体血淋巴中。ＲＩＡ结果表明,表达产物与天     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

牛疱疹病毒I型前早期基因BICPO的表达对牛免疫缺陷病毒LTR的反式激活…

由含有ＢＨＶ－１（Ｂｏｖｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ－１）前早期基因的基因组片段亚克隆ＩＣＰＯ（ＢＨＶ－１Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ）的ＤＮＡ序列至表达载体ｐＳＶＤ３,构建质粒ｐＳＶ２．９。将该质粒与ＰＢＬＴＲ－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,ＢＩＣＰＯ的表达产物可以显著地激活ＢＩＶ ＬＴＲ启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据ＰＳＶ２．９与含有Ｂ     

人生长激素基因在昆虫细胞中的表达(英文)

近年发展起来的昆虫细胞－杆状病毒基因工程系统具有良好的优越性：（１）表达产量高,（２）产物的免疫原性、功能性类似于天然产物,（３）适用于悬浮及无血清培养。本实验中,将外源基因ｈＧＨ克隆至质粒ｐＶＬ１３９３,形成转移载体ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ（Ｆｉｇ．１＆２）。与昆虫核多角体病毒ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ９（Ｆｉｇ．３）,ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ与ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ发生同源重组,取代多角体蛋白基因。经空斑分析纯化得到不含多角体,单一表达的重组病毒ｒＡｃＶｈＧＨ（Ｆｉｇ．４）,感染滴度达到２．０３ｘ１０８ＰＵＦ／ｍＬ。经反复实验,１０５细胞／ｍＬ感染６～７天后收获培养上清液,可得到表达量为４０μｇ／ｍＬ的ｈＧＨ蛋白（Ｆｉｇ．５,６＆７）。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）组合突变体FrGGl在CHO细胞中的…

为了得到ｔ－ＰＡ组合突体ＦｒＧＧｌ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧｌ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０＾－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１     

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了ｐＣＨＢＳＳＩＧ质料,其特点是ＣＭＶ立即早期启动子调控乙型肝炎（乙肝）表面抗原Ｓ＋前Ｓ１融合基因在前,ＳＶ４０早期启动子调控ＧＳ扩增基因在后,此质粒转化到ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中,经克隆加ＭＳＸ及ＭＴＸ筛选、扩增,建立了７个高效表达乙肝表达抗原Ｓ及前Ｓ１融合蛋白细胞系ＧｄＳＳ１,并检测了其中ＧｄＳＳ１－１８细胞系的生物学特性,结果表明：未发现微生物污染,无致瘤性、遗传稳定,电镜下可观察到２     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达ＧＳＴ融合蛋白的重组病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－－ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８感染Ｓｆ９细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,结果显示５３ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８）呈不溶状态。在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠致终浓度１．５％,并将Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的比例由１％提高到２％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示至少有１／     

人乳头瘤病毒16型E6基因的T—A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应,可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白,拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ,按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中,置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下,用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ,免疫印迹实验表明,此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ。同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。     

Insecticidal activity of the chitinase from the Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus

Baculovirus chitinase gene (chiA) is a late gene essential for liquefying the host insect at a late stage of infection for its hydrolyzing chitin function. In a previous report, baculovirus ChiA has been shown to offer many interesting new opportunities for pest control. Recently, a putative chiA gene was identified in the Korean isolate of the Spodoptera litura nucleopolyhedorvirus (SpliMNPV‐K1) genome. The open reading frame (ORF) contains 1692 nucelotides and encodes a protein of 563 amino acids with a predicted molecular weight of about 62.6 kDa. To study the insecticidal activity of ChiA from SpliMNPV‐K1, we constructed a recombinant AcMNPV, Ap‐SlChiA, which is designed to express the ChiA under the control of a polyhedrin promoter. Western blot analysis indicated that ChiA was successfully expressed by this recombinant virus. Chitinase assay revealed that the chitobiosidase and endochitinase activity of the recombinant virus was 2.5‐ and 3.9‐flods higher than those of wild‐type AcMNPV, respectively. In addition, the recombinant virus showed higher evident insecticidal activity against 3rd instar larvae of Spodotera exigua than that of the AcMNPV. These results suggest that the chiA gene from SpliMNPV‐K1 could be successfully applied to improve pathogenicity of baculoviruses.     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

杆状病毒p74基因具有种属特异性

选用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒 (AcMNPVbacmid)为材料 ,通过在大肠杆菌中利用RecA基因介导的同源重组 ,将其p74基因剔除 ,并精确地用斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)的p74基因进行了替换。所构建的重组AcMNPV杆粒在修饰后的p74基因位点中未留下任何有可能影响该基因表达及功能的选择标记 ,SpltMNPV的p74基因直接位于AcMNPVp74基因的启动子控制下。RT PCR显示替换后的p74基因得到了表达。生物测定结果显示 ,重组病毒AcMNPV杆粒 polhSL74无法通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫 ,表明杆状病毒p74基因具有种属特异性。     

ORF98 of Autographa californica nucleopolyhedrosisvirus is an auxiliary factor in late gene expression

Autographa californica nucleopolyhedrosisvirus (AcMNPV) is the type member of the family Baculoviridae. Gene expression of AcMNPV during virus infection is temporally regulated. A series of late expression factors (LEFs) are required for late gene expression to take place. A number of additional factors have also been shown to more modestly influence late gene expression. Using the LEF transient assay, we scanned the AcMNPV genome for such factors by replacing plasmids using the LEF genes with larger clones and then looked for increases in late gene expression using a reporter plasmid under the control of a late promoter. Using this approach, ORF98 was identified as having a stimulatory effect on late gene expression. The ability of ORF98 to influence early, late, and very late gene expression was established. Furthermore, tagged versions of ORF98 were localized to the nuclei of transfected cells and were shown to interact with each other as homo-oligomers. Potential roles of ORF98 in baculovirus infection are discussed.