A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

pH和CO2对大鼠肺微血管和主动脉内皮细胞NOS活性及mRNA表达的影响

为从蛋白水平和基因表达水平探讨ＮＯ在高碳酸血症引起肺血管收缩而导致肺动脉高压中的作用环节 ,本实验采用体外培养大鼠肺微血管内皮细胞 (ＰＭＥＣｓ) ,分别研究单纯改变 ｐＨ与单纯改变ＣＯ2 浓度对其一氧化氮合酶 (ＮＯＳ)活性及其ｍＲ ＮＡ表达的影响 ,并比较ＰＭＥＣｓ和大血管主动脉内皮细胞 (ＡＥＣｓ)的异同。1　材料和方法用ＳＤ大鼠按Ｃｈｅｎ方法在ｐＨ 7.4、5 %ＣＯ2 、37℃ＤＭＥＭ液中分离和培养ＰＭＥＣｓ和ＡＥＣｓ。取ＥＣｓ(1～ 2代 )以 1×1 0 5Ｃｅｌｌ/ｍｌ传代于预先放有盖玻片的培养瓶内 ,1 2ｈ后吸弃ＤＭＥＭ液 ,…     

小鼠造血干细胞增殖和分化的分子生物学证据

本文采用Ｙ染色体特异的性别决定基因（Ｓｒｙ）作为新的细胞遗传标志,通过ＰＣＲ技术来追踪观察造血干细胞的增殖与分化性能。该方法具有简便、灵敏和特异等优点。雌性受体小鼠输注雄鼠骨髓细胞和１３天脾结节（ＣＦＵ－Ｓ１３）细胞后,Ｓｒｙ ＰＣＲ测试受体小鼠的ＣＦＵ－Ｓ结果表明,它们均为供体来源的ＸＹ细胞。用Ｓｒｙ ＰＣＲ骨髓细胞和骨髓中脾结节生成细胞（ＣＰＵ－Ｓ）的长期重建造血能力,结果表明,在存活雌性小鼠     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及纯化抗原免疫原性的研究

本文报告了两个拷贝的adr亚型HBs基因的pSV2质粒组建,其中一个拷贝只含S基因,受SV40早期启动子的直接控制,另一个拷贝连接于pSV2质粒dhfr基因下游,含有前S和S基因及其本身的启动子,用此重组质粒转化CHO-dhfr~-细胞,经选择,获得了高效表达HBsAg的CHO-32-C23及CHO-Ⅱ-5细胞系,最佳培养条件及HBsAg分泌动态的研究结果表明,CHO-Ⅱ-5系细胞分泌HBsAg的最佳条件是37℃培养,培养基中加2％小牛血清,每日收换液;用5％小牛血清,每48小时收换液则次之,但较实用,转瓶培养产量约2.μg/ml,将CHO-32-C23细胞系产生的液体初步纯化,在聚丙烯酰胺凝胶上显示23k和27k蛋白带,用其免疫NIH小鼠,EDSO为0.119μg,对照血源菌ED_(50)为0.083μg,二者的免疫原性近似。     

逆转录病毒介导的HSV－tk在肿瘤基治疗中的应用

本实验将ＨＳＶ－ｔｋ基因构建在逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮｎｅｏ上,经ＰＡ３１７包装后,筛选出５ｘ１０￣５ｐｆｕ／ｍｌ的ＴＫ包装细胞。用该细胞培养上清感染体外培养细胞,并用Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ－ＧＣＶ处理,可以对增殖的细胞产生细胞毒害作用。细胞增殖速度越快,细胞毒害作用越强。在体内实验中,将ＴＫ细胞直接注射到移植瘤中或与瘤组织悬液混合接种同种小鼠。再用ＧＣＶ治疗,对肿瘤有较强的生长抑制作用。     

人α降钙素基因相关肽与肿瘤坏死因子的融合表达

用半酶和半化学合成的方法合成和克隆了人ａ降钙素基因相关肽基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子之后插入表达载体ｐＳＢ－９２中,使融合基因的５＇端直接置于大肠杆菌ＰＬ启动下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,使ＴＮＦ与ＣＧＲＰ融合蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白既有ＣＧＲＰ的结合活性（酶标检测为阳性）又有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ－９２９细胞的细胞毒活性）。表达菌裂解液走ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示     

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和 Ｇ Ｕ Ｓ 基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ ｂ） 和ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ） 导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中,然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选,获得一批 Ｂｔ 转基因株。经 Ｐ Ｃ Ｒ、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交及 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析证实此二基因已整合进水稻中,饲虫试验结果表明,转基因株具有１００ ％ 杀虫率。     

抑制肺癌及乳癌的基因

许多基因编码抑制细胞生长的蛋白质 ,这些基因中的某些基因抑制肿瘤生长 .以前发现ＢＲＣＡ1基因抑制乳癌生长 ,现发现基因ＲＡＳＳＦ1Ａ也是这种基因 .在 2 0 0 1年 5月 2日的ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ上报道的一项研究确认 ,许多肺癌与乳癌缺乏有功能的ＲＡＳＳＦ1Ａ .研究者发现 ,将恢复ＲＡＳＳＦ1Ａ功能的人癌细胞移植到小鼠体内 ,可防止小鼠发生肿瘤 .研究者用外科手术从肺癌和乳癌病人身上取得癌细胞来创建可在实验室生长的细胞系 .从小细胞肺癌病人取得的 32个细胞系中的ＲＡＳＳＦ1…     

苏云金芽孢杆菌Cyt蛋白研究进展

苏云金芽孢杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,简称Ｂｔ)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂 ,也是公认的无公害生物农药。苏云金芽孢杆菌最主要的杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白 (ＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌＣｒｙｓ ｔａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ,ＩＣＰｓ) ,包括晶体蛋白 (Ｃｒｙ)和Ｃｙｔ蛋白 (Ｃｙｔ)两大类。这两类蛋白在氨基酸序列及其基因同源性上相距甚远 ,但它们均能在靶标害虫中肠内被激活成毒素 ,并在昆虫中肠细胞膜上形成孔道 ,进而引起中肠细胞胶样渗透裂解 (ｃｏｌｌｏｉｄ ｏｓｍｏｔｉｃｌｙｓｉｓ) ,最…     

腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备

利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD (可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白) 蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量 (MOI) (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFa的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７,经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆,用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６,得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,经ＰＣＲ检测,ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性,结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α链（GM-CSFRα）的克隆与表达

ＧＭ-ＣＳＦ高亲和力受体至少由两条链组成,低亲和力的α链及无结合力活性的β链。本文采用ＲＴ-ＰＣＲ的方法,从ＧＭ-ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ-１中克隆了全长的ＧＭ-ＣＳＦＲα链Ｃｄｎａ（包括信号肽部分）,经酶切及全基因测序鉴定,并分别在原核及真核细胞表达系统中表达。在大肠杆菌中ＧＭ-ＣＳＦＲα以ＧＳＴ融合蛋白形式表达,谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化融合蛋白。ＧＳＴＣＳＦＲαＣ无受体活性,推测主要与缺乏翻译后修饰有关。将全基因克隆入真核表达载体Ｐｓｖｌ中,转染ＣＯＳ-７细胞瞬时表达以重建ＧＭ-ＣＳＦ的低亲和力受体,１２５ＩＧＭ-ＣＳＦ平衡结合实验证明转染后的ＣＯＳ-７细胞膜上有受体的表达,Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ显示表达的受体α链分子量略低于ＴＦ-１细胞。胞外区基因（ＣＳＦＲαＢ）克隆入Ｐｓｖｌ构建的Ｐｓｖｌ／ＣＳＦＲαＢ表达载体,转染ＣＯＳ-７细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达细胞上清,有单一的反应带,表达上清有ＧＭ-ＣＳＦ的受体活性。     

苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及其转化性能

逐级从４２ ℃到４４ ℃和４６ ℃升温培养、并用０－０５ ％ ＳＤＳ 处理苏云金芽孢杆菌ＹＢＴ１４６３ ,获得了一系列内生质粒被部分或完全消除的无晶体（Ｃｒｙ －） 突变株,对４ 种Ｃｒｙ － 突变株的转化性能及导入的外源质粒的稳定性进行了研究。用限量培养基和４２ ℃培养筛选到Ｃｒｙ － 突变株后,升温至４４ ℃,从Ｃｒｙ － 突变株得到内生质粒被进一步消除的突变株;然后升温至４６ ℃来培养其中突变株ＢＭＢ１７０ ,并用０－０５ ％ 的ＳＤＳ进行处理,最终筛选到１ 株无质粒突变株ＢＭＢ１７１ 。用ｐＨＴ３１０１ 、ｐＢＭＢ１７３６ 、ｐＢＴＬ１ 和ｐＨＶ１２４９ 等４ 种外源质粒进行的转化及稳定性研究表明,转化频率的大小及导入质粒的稳定性与用作受体菌的Ｃｒｙ － 突变株携有的内生质粒数之间呈现一定的相关性,Ｃｒｙ－ 突变株的转化频率显著高于出发菌株,其中ＢＭＢ１７１ 的转化频率最高达１０７ 转化子／μｇ ＤＮＡ,且所导入的外源质粒的稳定性也高于其它Ｃｒｙ － 突变株及出发菌株ＹＢＴ１４６３ 。     

人胸腺上皮细胞培养上清液促进鼠胸腺细胞和细胞株增殖的研究(英文)

胸腺是细胞分化发育的场所,源于骨髓的前Ｔ细胞。在以胸腺上皮细胞为主体的基质细胞作用下,增殖、分化、成为成熟Ｔ细胞,迁移至外周。胸腺基质细胞通过细胞与细胞之间的直接接触和分泌细胞因子影响细胞分化发育的各个阶段。本文探讨了人胸腺上皮细胞培养上清液（ＴＥＣＳＮ）对鼠胸腺细胞、８５、Ｂｅ１３、ＨＤＭａｒ、Ｍｏｌｔ４、Ｒｅｈ以及Ｊｕｒｋａｔ细胞株增殖的影响。取人胸腺组织,用０．１５％的胰酶消化组织块后,将其接种到培养瓶中进行培养,收集上清液。将ＴＥＣＳＮ加到鼠胸腺细胞悬液中,２ｈ后加３ＨＴｄＲ,观察鼠胸腺细胞自发性掺入３ＨＴｄＲ有无改变。同时将ＴＥＣＳＮ＋ＣｏｎＡ加入鼠胸腺细胞悬液中培养４８ｈ,收获细胞前１８ｈ加入３ＨＴｄＲ,测定ＣＰＭ值。此外,ＴＥＣＳＮ加入８５细胞株及其它细胞株悬液中,观察ＴＥＣＳＮ对这些细胞株增殖的影响。上述各实验均设有对照组（Ｔａｂ．１）。结果表明：ＴＥＣＳＮ本身能增强鼠胸腺细胞３ＨＴｄＲ自发掺入,其３ＨＴｄＲＣＰＭ值明显大于对照组（Ｆｉｇ．１）。ＴＥＣＳＮ单独使用不影响胸腺细胞增殖,ＣｏｎＡ单独作用能促进鼠胸腺细胞增殖反应,而ＴＥＣＳＮ与ＣｏｎＡ共同使用,胸腺     

干扰素膜蛋白Tet-on系统稳定细胞系的建立及对CA16病毒的抑制作用

通过Tet-on调控系统,构建受多西环素诱导表达干扰素诱导的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane proteins 1/2/3,IFITM1/2/3)基因的HeLa细胞系,并初步探索了IFITM蛋白对柯萨奇病毒A16(CA16)的抑制作用.首先将调控质粒pTet-on转染进入HeLa细胞,通过G418筛选出阳性克隆细胞系,在此细胞系基础上共同转染反应质粒pTRE2-IFITM1/2/3和伴侣质粒pTK-Hyg,通过潮霉素筛选出单克隆细胞系,加入多西环素后利用Western印迹筛选出可诱导表达IFITM1/2/3蛋白的单克隆细胞系.使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现,多西环素诱导表达的IFITM蛋白对不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的CA16具有明显的抑制作用,其中IFITM 3对CA16的抑制效果最为明显.Tet调控IFITM1/2/3基因表达HeLa细胞系的成功建立,为进一步研究IFITM基因的功能及其抗病毒机理提供了一个理想的细胞模型.     

poly(dA:dT)促进体外培养的人绒毛组织AIM2炎性体活化

目的:在妊娠过程中,胎盘可能暴露于多种病原微生物,威胁胎儿正常生长发育。为探讨人胎盘绒毛组织是否表达AIM2炎性体成员基因以及人胎盘组织的AIM2炎性体的活化形式。方法:以THP-1细胞来源的RNA和蛋白作为阳性对照,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测人早孕期胎盘绒毛组织中AIM2炎性体两个相关基因AIM2和ASC的表达。分离和体外培养人胎盘绒毛膜组织,并用不同浓度的poly(d A:d T)进行转染,处理24小时后,分别收集组织培养上清和蛋白裂解液,Western blot检测蛋白裂解液中caspase-1的活化,ELISA检测培养上清中IL-1β的分泌。结果:RT-PCR和Western blot结果均显示人早孕期胎盘绒毛组织组成性表达AIM2炎性体相关基因AIM2和ASC。同时,体外培养的人胎盘绒毛组织在转染5μg/m L poly(d A:d T)后,caspase-1剪切片段p10显著增多,培养上清中IL-1β分泌也显著增多(P0.01)。结论:人胎盘绒毛组织存在功能性的AIM2炎性体,能够被胞内双链DNA活化。     

辣椒疫霉致病毒素

辣椒疫霉在培养液中振荡培养时可分泌毒素,这种纱能经志辣椒叶片形成水渍状褐腐斑,类似病原菌侵染后形成的症状,Ｐｌｉｃｈ’ｓ和Ｖ８Ｃ２液适于Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ的生长和产毒;生长适宜温度和ＰＨ范围分别为２０－３０℃和ＰＨ６－７,在２５－３０℃、Ｐ５－８的条件下２滤液毒性最强;培养１５天产毒达到最高值,液先后经８５％硫酸铵沉淀,ＤＥ５２、Ｃ几ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层将毒素纯化。经鉴定该纯毒素为３９．８     

从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌DNA的方法*

豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌、破碎后直接加入 2 0 0 μL 4mol/L异硫氰酸胍 (GUTC)裂解液混匀 ,离心去掉根瘤残留物 ,再加入适量RNA酶 ,37℃温育 30min后 ,加入 2 0 μL硅藻土吸附液 ,室温处理 1 5min离心去掉上清 ,沉淀经GUTC裂解液二次处理 ,再分别用洗涤液、 70 %酒精洗涤。最后 ,硅藻土沉淀经真空干燥 ,加入 2 0 μL超纯水洗涤硅藻土沉淀 ,即可获得类菌体根瘤菌DNA。所获得的DNA可以用于AFLP、 1 6SrRNAPCR反应。     

人白细胞介素－2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从pHIG53质粒内切下人白细胞介素-2(IL-2)cDNA基因, 并经中间质粒pSP72转换成与pDOR-neo载体相匹配的酶切位点, 然后将IL-2cDNA定向连接入pDOR-neo载体, 构建成功人IL-2逆转录病毒载体, 经脂质体导入人骨肉瘤细胞系Ma中, 经G418筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中IL-2表达量, 每1×10⁵细胞24hIL-2表达量为50～800U, 为骨肉瘤的基因治疗创造条件.