鳜鱼病毒病原及细胞感染特性的研究

在患暴发流行性发病鳜鱼的脾、肾、肝、鳃组织细胞的超薄切片中观察到直径为120-150 nm的二十面体病毒粒子,其截面呈六角形,有囊膜.将病鱼内脏与10倍体积的PBS缓冲液制成组织匀浆液,过滤除菌后感染对数生长期的草鱼肾细胞.结果表明,该感染液在28 ℃条件下,培养36-48 h,生长旺盛的草鱼肾细胞开始出现CPE,5-7 d感染的单层细胞逐渐脱落死亡.该细胞病毒悬液具有感染性,可持续稳定地进行传代培养.感染细胞的病毒培养液,经差异离心纯化,负染制片,电镜下观察到大量的病毒粒子,对照培养物中未发现任何病毒颗粒.     

鳜鱼病毒病原的检出及组织病理分析

经对患暴发性传染病的鳜组织及病变组织超微切片的电镜观察,在细胞质,核及间隙中都有病毒颗粒,对该病毒进行了分离提纯,这是一种直径约为２８０ｎｍ球形病毒,将粗提病毒液接种到培养细胞中,会引起细胞病变;病毒通过人工感染健康鳜,会引起鳜发病和死亡,对患病獗进行解剖和组织病理观察,表明病鳜的５种器官都发生了病变,研究结果表明分离的鳜病毒（ＳｉｎｉｐｅｒｃａｃｈｕａｔｓｉＶｉｒｕｓ,ＳＣＶ）是引起鳜流４行的病     

口蹄疫病毒持续感染细胞系的快速选择及其特性研究

采用NH4Cl弱碱法处理感染口蹄疫病毒的叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK—21),存活细胞经过单克隆和选择,获得32株阳性克隆细胞株。随机选取一株(BHK—ROp),常规传代并采用RT-PCR,透射电子显微镜,流式细胞仪进行持续感染特性分析,结果表明,BHK—ROp第4,16,36代细胞中病毒持续存在,但不影响细胞的生长特性,表现出病毒持续感染的基本特征。可见,NH4Cl弱碱法用于建立病毒持续感染细胞系是十分有效的。     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究.结果表明,GCRV873、GCRV875、GCRV876在-30℃保存10年后仍然具有一定的感染性,其滴度均在102TCID50/mL以上,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价.经传代培养后,四株GCRV的毒力逐渐升高,并趋于稳定;当感染复数(MOI)为0.05PFU/cell时,测定四株GCRV的滴度均高于108 TCID50/mL,但略有差异.GCRV873的滴度最高,可达到6.4×1011 TCID50/mL.连续传代的GCRV毒株在不同温度(28℃、31℃、34℃、37℃、41℃)条件下,均可感染CIK细胞;在28℃时,感染效价最高,随着温度的升高,其感染效价逐渐降低.     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873 、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究。结果表明 ,GCRV873 、GCRV875、GCRV876在 - 30℃保存 10年后仍然具有一定的感染性 ,其滴度均在 10 2 TCID50 /mL以上 ,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价。经传代培养后 ,四株GCRV的毒力逐渐升高 ,并趋于稳定 ;当感染复数 (MOI)为 0 .0 5PFU/cell时 ,测定四株GCRV的滴度均高于 10 8TCID50 /mL ,但略有差异。GCRV873 的滴度最高 ,可达到 6 .4× 10 11TCID50 /mL。连续传代的GCRV毒株在不同温度 (2 8℃、31℃、34℃、37℃、41℃ )条件下 ,均可感染CIK细胞 ;在 2 8℃时 ,感染效价最高 ,随着温度的升高 ,其感染效价逐渐降低     

A型流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒生物学性状的初步研究

为明确E61-24-P15 A型重组流感病毒的第189代传代子病毒(IVpi-189)是否具备流感病毒温度敏感减毒活疫苗候选株的特点,将IVpi-189病毒感染MDCK细胞,并于不同培养温度条件下培养,观察其致细胞病变效应,病毒合成、释放情况,以及不同温度条件下病毒存活时间。结果显示32℃培养温度下,IVpi-189病毒具有等同于亲代野生病毒株的诱导细胞病变能力,而当培养温度上调至38℃,IVpi-189病毒致细胞病变效果出现缓慢且程度明显减轻。空斑形成单位实验发现IVpi-189病毒在38℃培养条件下增殖能力明显下降,其原因与病毒灭活速度及子病毒释放无关,但与感染细胞病毒合成能力下降有关。上述实验结果初步证实流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒具有温度敏感减毒活疫苗的生物学特性,在许可培养温度条件下具有良好的增殖能力,而在非许可培养温度下,病毒增殖活性受到明显抑制。本研究为流感病毒减毒活疫苗的开发研制提供实验佐证。     

蓝舌病毒HbC3对几株人和动物肿瘤细胞的感染特性研究

用BTV-HbC3感染人肺癌SPC—A-1细胞,人宫颈癌HeLa细胞,人星型胶质瘤U251细胞,小鼠星形胶质瘤C6细胞及人胚肺HEL细胞后,观察细胞病变效应(CPE);运用透射电镜技术及琼脂双扩散试验检测BTV-HbC3对各种不同肿瘤细胞及人胚肺HEL细胞的感染性;并用RT-PCR技术检测蓝舌病毒的增殖情况。结果显示,BTV-HbC3对正常HEL不感染,但能在不同来源的某些肿瘤细胞中选择性增殖,产生不同程度的细胞病变效应(CPE)及调亡现象,终致肿瘤细胞死亡。其中以人肺癌SPC-A-1细胞对其最为敏感。因此,初步认为BTV-HbC3株能靶向性杀死某些肿瘤细胞,从而为深入开展BTV-HbC3靶向性抗肿瘤的研究提供了第一手实验室依据。     

鳜鱼消化道黏液细胞和6种酶的组织化学定位

采用阿利新蓝-过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色和酶组织化学方法对鳜鱼消化道各部位黏液细胞和6种酶的分布与定位进行了研究。结果显示,黏液细胞可为分为4种类型,食道黏液细胞多数为Ⅲ型和Ⅳ型,未见Ⅰ型和Ⅱ型;胃贲门和胃幽门黏膜上皮仅有Ⅰ型黏液细胞;胃体黏膜上皮则以Ⅲ型细胞为主;幽门盲囊中主要为Ⅱ型细胞;前肠和中肠中Ⅳ型黏液细胞最多,Ⅰ型最少;后肠黏液细胞则以Ⅳ型和Ⅱ型为主。酸性磷酸酶(ACP)主要分布于幽门盲囊和前肠的黏膜上皮;碱性磷酸酶(ALP)主要分布于食道、幽门盲囊和整个肠道黏膜上皮;非特异性酯酶(NSE)主要分布于胃幽门、中肠和后肠黏膜上皮;过氧化物酶(POX)在胃幽门黏膜上皮中活性较高;琥珀酸脱氢酶(SDH)主要分布于胃腺中;腺苷三磷酸酶(ATPase)在消化道各部位均有较多分布。鳜鱼消化道黏液细胞和酶的分布型与其它动物有相似之处,也有其一定的特异性,与消化道不同部位的消化吸收机能相适应。     

鳜鱼视觉特性及其对捕食习性适应的研究

采用电生理方法研究了夜行性凶猛鱼类鳜鱼视网膜电图的一般特性,光谱敏感性和适应特性。鳜鱼的视网膜电图不显示典型的混合型视网膜特征,明视和暗视视网膜电图的光谱敏感曲线形状基本相同,峰值都在５３０ｎｍ处,没有出现Ｐｕｒｋｉｎｊｅ氏位移,明适应曲线仅出现下降型变化,暗适应过程异常缓慢,鳜鱼的视网膜仅存在单一的光感受系统,即暗视系统,不可能形成色觉,但鳜鱼视网膜具有很高的光敏感性,适于弱光视觉。     

鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性

用紫外线灭活的草鱼呼肠孤病毒（ＧＣＲＶ）诱导鲫鱼囊胚细胞（ＣＡＢ）能产生一种高滴度的抗病毒物质。这种物质在５６℃及ｐＨ２￣１１稳定;对雎蛋白酶敏感;抗病毒活性脘被保护细胞的密度、培养温度及保护时间的影响;不能被ＧＣＲＶ的特异性抗体中和;无直接杀病毒作用;抗病毒机制依赖于细胞内ＲＮＡ和蛋白质的合成;在多种鱼类培养细胞中具有抑制病毒作用。这些特性与哺乳类α／β干扰素一致,是一种鲫鱼干扰素。     

鳜皮肤图案中色素细胞的分布与排列

色素细胞是皮肤图案形成的基础,为了解鳜(Siniperca chuatsi)皮肤图案区域色素细胞的种类、分布及排列特征,采用光学显微镜与电子显微镜对鳜皮肤中图案区域、非图案区域及交界处皮肤的色素细胞进行显微及超显微结构观察。结果显示,鳜皮肤中含有黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞及虹彩细胞,主要分布于表皮层和色素层。头部过眼条纹、躯干纵带、躯干斑块等图案区域皮肤表皮层与色素层均含有黑色素细胞,非图案区域仅表皮层含有少量黑色素细胞。躯干图案区域(纵带、斑块)皮肤色素层色素细胞分布层次明显,由外到内依次为黄色素细胞、红色素细胞、黑色素细胞和虹彩细胞,其中,虹彩细胞内反射小板较长,整齐水平排列;躯干非图案区域皮肤色素层由外到内依次为黄色素细胞、红色素细胞和虹彩细胞,其中,虹彩细胞内反射小板较短,无规则排列。头部过眼条纹色素层含有4种色素细胞,色素细胞数量较少,且无规则排列,其中,黑色素细胞内黑色素颗粒较大。交界处皮肤色素层黑色素细胞数量向非图案区域一侧逐渐减少,虹彩细胞数量逐渐增加。结果表明,鳜图案区域与非图案区域、不同图案区域的色素细胞分布与排列各不相同,本研究结果为鳜色素细胞图案化形成机...     

鳜消化系统器官发生的组织学

利用形态学观察和连续组织切片技术,对出膜后0-35d的鳜仔稚鱼消化系统胚后发育的组织学特征进行了系统研究.结果表明,试验水温为18.0-20.0℃时,鳜初孵仔鱼消化道仅为一段位于脊索下方、卵黄囊上方的实心细胞索,卵黄囊呈椭圆形,含有油球.孵化后第2天,口和肛门形成,消化道贯通.孵化后第4天,消化道上皮细胞出现分化,肝脏和胰脏出现,仔鱼开始由内源性营养向外源性营养转变.孵化后第5天,仔鱼开口摄食,消化道分化成口咽腔、食道、胃、前肠和后肠.孵化后第9天,卵黄囊完全被吸收.此后随着鱼体的生长,消化系统从结构和功能上逐步发育完善和成熟.孵化后第7天前肠中出现空泡,孵化后第8天仔鱼后肠中发现有嗜曙红颗粒,表明肠上皮细胞吸收了脂肪和蛋白质.在孵化后第13天,出现胃腺,标志着稚鱼期的开始.     

鳜早期味蕾发育的组织学特征

采用石蜡切片、H.E染色研究了3 ~ 28日龄鳜（Siniperca chuatsi）味蕾发育的组织学特征,并通过扫描电镜观察28日龄鳜口咽腔组织味蕾类型与数目。结果表明,未开口期（3日龄）,鳜口裂未张开,味蕾尚未分化;开口期（7日龄）,鳜口裂张开明显,味蕾呈椭圆形,突起高度平缓,主要分布在上下颌上皮上,舌、咽、鳃弓上皮上有少量分布;稚鱼期（14日龄）,味蕾呈圆锥形,突起高度上升,舌和咽上味蕾数目增加;21日龄,味蕾呈近梯形,突起高度不变,下颌、舌、咽上味蕾数增加,鳃弓上味蕾数目显著增加;28日龄,味蕾发育完全,口咽腔味蕾数继续增加。扫描电镜观察表明,鳜味蕾主要有3种类型：Ⅰ型味蕾近球形,含有大量微绒毛,突起高于上皮,味孔向外突起;Ⅱ型味蕾含有少量微绒毛,突起略高于黏膜上皮,味孔向内凹陷;Ⅲ型味蕾微绒毛含量最少,突起几乎与黏膜上皮共面,味孔平坦或凹陷。上下颌、咽、鳃中以Ⅰ型味蕾数量最多,Ⅱ型味蕾最少,舌上主要分布Ⅰ型味蕾,无Ⅲ型味蕾。结果表明,鳜早期味蕾结构发育与其摄食关联,推测其主要通过Ⅰ型味蕾和Ⅱ型味蕾对食物的机械性和化学成分进行识别。     

MRFs家族基因在翘嘴鳜成体不同组织及器官中的表达特征

生肌调节因子(MRFs)家族成员包括MRF4、Myf5、Myogenin和MyoD,是肌肉形成的关键控制因素,其作为一种转录因子在肌肉的发育分化过程中发挥重要作用。本研究通过RT-qPCR方法分析MRFs家族基因在翘嘴鳜成体中不同组织及器官的表达情况,阐明其在肌肉组织中的特异性表达。结果显示:MRFs家族基因在成体翘嘴鳜肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠道和脑组织及器官中均检测到表达,且在肌肉中的表达量显著高于其他组织及器官中的表达量(p<0.05)。为研究生肌调节因子在翘嘴鳜肌肉发育过程中的作用提供了基础资料。     

翘嘴鳜NADPH氧化酶2个催化亚基cDNA的克隆和表达特征

吞噬细胞NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧(reactive oxygen species, ROS),在机体的防御体系中起着非常重要的作用.本文利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法,克隆到翘嘴鳜NADPH氧化酶的催化亚基gp91phox和p22phox的cDNA全长.并研究两者在正常的翘嘴鳜和注射了柱状黄杆菌灭活菌苗（FKG4）的翘嘴鳜组织中的表达模式.结果表明,gp91phox基因cDNA序列全长2 037 nt,开放阅读框长度为1 698 nt,翻译成565个氨基酸;p22phox 基因cDNA序列全长1 296 nt,开放阅读框561 nt,翻译成186个氨基酸.将这2个亚基推导的氨基酸序列与人的对应亚基相比,相似性分别为68.7%和60.8%,且具有相似的结构域和功能域,说明翘嘴鳜与人的NADPH氧化酶具有相似的功能活性.半定量PCR分析显示,在翘嘴鳜血液、脑、心脏、肾、肝、脾、胸腺等11种组织中均能检测到gp91phox和p22phox的基因表达.经FKG4免疫后,gp91phox在翘嘴鳜血液、头肾和脾3种组织中的表达量显著上升,p22phox在头肾和脾2种组织中的表达量显著上升.由此推断,NADPH氧化酶可能参与了机体的抗菌免疫应答.     

GenBank数据库中鳜鱼微卫星位点的筛选及特征分析

微卫星(Microsatellite)是一类由2-6个核苷酸经多次单位串联组成的高度变异重复DNA序列(Schlotterer and Tautz,1992)。它具有按照孟德尔方式分离、突变快、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点,其核心序列在同一物种中具有保守性,因此,可以根据微卫星的侧翼序列设计合适的引     

鳜早期色素发育和色彩图案的形成

色彩图案作为最显著的外部形态特征之一,在动物生存与交流中起着重要的作用。为了解鳜(Siniperca chautsi)早期发育过程中这一形态特征变化,采用CCD-Adapter解剖镜对鳜早期(胚胎期至出膜40日龄)体表色素细胞种类与分布、主要图案(条、带、斑)的形成过程进行了观察,同时对不同部位皮肤进行组织切片观察。结果显示,胚胎期,最早观察到黑色素细胞,位于卵黄囊和油球,出膜前,头部出现黄色素细胞;出膜后,黑色素细胞发育最为显著,红色素细胞出现在眼球后部和躯干前部;5日龄后,黄色素细胞发育增加,鱼体各部位均有分布,黑色素细胞继续发育,图案形成开始。鳜早期色彩图案形成过程:(1)躯干纵带:5日龄,背部出现少量黑色素,14日龄,背鳍基部黑色素与腹部黑色素相连;(2)头部过眼条带:10日龄,鳃盖后上方黑色素明显增多,12日龄,眼球后部经鳃盖后上缘至背部前端的条带形成,17日龄,上颌至眼球前部的条带形成;(3)头顶条带:6日龄,头顶正上方黑色斑点增多,18日龄,头部上方黑色斑块分别向前、后延伸,23日龄,头顶正上方黑色条带基本形成;(4)躯干斑块:8日龄,尾部底端出现一个较小的黑色斑块,15日龄,尾柄前部出现3个不规则黑色斑块,25日龄,躯干中后部5个近圆形黑色斑块形成。结果表明,鳜胚胎期至出膜40日龄,体表出现黑色素细胞、黄色素细胞和红色素细胞,体色以黑色为主,主要条带或斑块在仔鱼5日龄后按不同方式逐渐形成,不同皮肤部位的色素层组成与分布方式不同。     

鳜牙齿形态结构及与不同种属间比较观察

牙齿是肉食性鱼类重要的摄食器官.为探究鳜(Siniperca chuatsi)牙齿形态结构,采用解剖镜观察了鳜牙齿分布、形态与数量.并比较其与大眼鳜(S.kneri)、斑鳜(S.scherzeri)及中国少鳞鳜(Coreoperca whiteheadi)牙齿差异.采用茜素红染色、组织切片、扫描电镜、X射线能谱及红外光...     

鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验

【目的】通过对从患病的鳜(Siniperca chuatsi)肝脏中分离得到的一株优势菌WJ2014-1进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后鳜维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病鳜肝脏分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S r RNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】用菌株WJ2014-1进行人工回归感染试验后,鳜发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S r RNA基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌。该菌株对复方新诺明、强力霉素、罗红霉素、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种抗生素耐药。【结论】分离得到的菌株WJ2014-1对鳜有致病性,生产中可选用复方新诺明、强力霉素、罗红霉素等药物进行防治。